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利用AgilentZORBAXRRHD亚2μm300二苯基UHPLC色谱柱对
利用 Agilent ZORBAX RRHD 亚 2 µm 300
二苯基 UHPLC 色谱柱对还原态和完整的
单克隆抗体进行超快速高分离度分离
应用简报
生物制药
作者 摘要
James Martosella, Phu Duong 通过优化色谱条件,利用 Agilent ZORBAX 超高压快速高分离度(RRHD)300 二苯基反
Agilent Technologies, Inc. 相色谱柱实现对完整的和还原态单克隆抗体(mAbs)的快速分离。独有的二苯基固定相
2850 Centreville Rd
和耐用的超高压快速高分离度色谱柱技术与梯度洗脱条件优化相结合,在高通量 mAb 表征
Wilmington, DE
中实现了超快速分离,获得了优异的峰形。在短时间内高分离度、高效分离了分别由中国
19808
仓鼠卵巢细胞和 CDH 媒介细胞株表达的两种单克隆抗体,并对结果进行了评价和比较。在
重现性和柱寿命的连续考察过程中,在较高的操作压力和温度下对 ZORBAX RRHD 300 二
苯基色谱柱进行了评价,结果表明其具有较高的操作耐受性。
引言 还原和烷基化
在盐酸胍(GuHCl)变性条件下使单克隆抗体还原并发生烷基化,
制药领域中生物治疗药物的开发正处于快速发展,而可靠的抗体
以获得游离的轻链和重链亚型。用水对 ( )抗
0.5 mL 1.5 mg/mL
药物表征是该类药物开发过程中的关键挑战。虽然抗体可以通过
体溶液进行透析,以除去防腐剂。透析完毕后,立即用 100 mM
多种分离技术来表征,但 由于近期诸如亚 2 µm 色谱柱填料和新
TRIS-HCl 和 4 M GuHCl 溶液稀释 0.5 mL 的透析液,使其最终浓
型固定相等更加高效和出色的色谱材料的使用,采用反相色谱技
度为 0.75 mg/mL (马林克罗特,菲利普斯堡,新泽西,美国)。
术分离抗体获得了快速发展。
将 pH 值调到至 8.0 ,加入 10 µL 0.5 M 的二硫苏糖醇(DTT,
本 文 中 ,我 们 实现 了 短 时 间 内 对 完 整 和 还 原 态 单 克 隆 抗 体 Sigma)贮备液,使其最终浓度为 5 mM。将混合液置于 37 °C 水
( )的超高分离度分离,并且表现出传统 、 和 浴中孵育 30 min。然后将抗体快速冷却到室温,加入 26 µL 0.5 M
mAbs C18 C8 C3
色谱柱表征难以企及 的选择性。具体而言 ,我们在高温下系统优 的碘乙酰胺(IAM,Sigma)贮备液,使其最终浓度为 13 mM。
化了梯度洗脱条件,实现了完整 mAb 与还原态轻链和重链 mAb 将烷基化的抗体溶液室温下避光放置
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