冷冻干燥法制备葵花籽降压肽前体脂质体.DOC

冷冻干燥法制备葵花籽降压肽前体脂质体 冻干保护剂的选择 药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成，离子浓度的增加，PH值的改变和相分离等情况。因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。在冻干脂质体中,冻干保护剂需要满足两个要求:①产品外观上应饱满致密,可以形成有一定硬度的饼状物;②需要有玻璃态存在,保护脂质体膜不致受到结晶的机械破坏。 常用的保护剂有如下几类物质， 糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等 无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等 表面活性剂：Tween 80等 氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等 盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等 本实验对常用的几种冻干保护剂甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖进行了考察 葵花籽降压肽脂质体的制备 方法一 0.降压肽制备：提蛋白==碱性蛋白酶1h（ph 9-10）==风味蛋白酶1h（ph7）===灭 酶===离心（＞8000，20-30min）==取上清液===测含量==计算多肽的量 按合适的质量比取适量的冻干保护剂，用pH6.5的磷酸缓冲液溶解,置恒温水浴中备用.（具备） 另取适量葵花籽降压肽（1：20磷脂）、PEG（磷脂的5%）、大豆磷脂及胆固醇（4：1）加入少量无水乙醇（）中,水浴加热（40℃，30min保温）溶解,配成脂质溶液。 将冻干保护剂溶液倒人脂质液中,振荡混匀,于超声波探头中进行超声波破碎，取出后冷冻保存，冷冻干燥8小时。 包埋率测定 Determination of entrapment efficiency The amount of unassociated peptides (W1) was determined according to Panico et al (1993) with some modifications, by reaction of the supernatant solution obtained from centrifugation (10,000g, 30min) with Cu2+ and bicinchoninic acid (BCA), and evaluation of absorbance increase at 562 nm. Empty liposomes were used as blank cuvettes in order to correct for turbidity effect. A standard working curve was constructed from bovine serum albumin (BSA). The incorporation of peptides (W2) into liposomes after the two washing cycles was added some methanol in order to disruption liposome wall, and calculated by the difference from the initial amount of peptides added. The %entrapment was calculated according to the following equation: % entrapment = [W2/(W1+W2)]×100. Panico, A.M., Pignatello, R., Mazzone, S., Cardile, V., Bindoni, M., Cordopatri, F., Villari, A., Micali, N. and Mazzone, G. (1993) Lipid vesicles loaded with thymopentin: characterization and in vitro activity on tumoral cells. Int. J. Pharm. 98, 19-28. （选取影响脂质体载药量的5个主要因素：PEG添加量、葵花籽多肽（g）与大豆磷脂（g）的比值（A）、磷脂和胆固醇比（B） 和超声波处理强度（C）、超声波时间（D）等）取葵花籽降压肽前体脂质体,加人lml水充分混匀,即可得到葵花籽降压肽脂质体。前体脂质体是将脂质体膜材、药物和适宜附加剂用适当的方法制成的一种前体制剂,当加水或药物水溶液稀释或水化时即能转化为脂质体。 方法二 反相蒸发法 称取一定量的大豆卵磷脂和胆固醇，溶于乙醚得到透明澄清的类脂溶液；