hxy-第五章-基因军的重组与转移.pptVIP

直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 3. 显微注射法(microinjection) 二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。 4. DEAE---葡聚糖传染法 葡聚糖 葡聚糖+DNA 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。 DEAE-dextran 细胞 外源DNA 预处理 摄入 DEAE-dextran 外源DNA 细胞 混合 DEAE-dextran对细胞有毒! 5. 病毒（virus）介导 （详见另外章节） 小结： 外源基因导入细胞的方法 2. DNA插入的方向正确 （1）用双酶切 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 （2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTC T 重组 但移码突变！ 4. 防止载体自身环化 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 5’ 3’ 载体 插入片断 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 五、载体和外源DNA插入片段的连接结果 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 五、载体和外源DNA插入片段的连接结果 感受态细胞(Competent cells): 具有接收外源DNA能力的受体细胞。 转化过程所用的受体菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 转化子(Transformant)：转化成功后带有异源DNA分子的受体细胞。 * 第二节 重组体导入细菌细胞 1. 目的 增加受体菌细胞膜的通透性。 第二节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。 2. 菌种 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 3. 制备原理 4. 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的50mMCaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 用冰冷的50mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的50mMCaCl2重悬 二、重组DNA导入大肠杆菌 转化(Transformation)：将外源DNA分子导入受体细胞内的过程。是分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 1.转化（transformation) 每?gDNA转化成功的细菌克隆数（cfu/μg）。 3. 转化方法 2. 转化率 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 90s 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA （1）热休克法 LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2°C离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV,25?F 脉冲控制器200-400? 0.5?g质粒DNA On ice混合 加入1mLSOC培养液 37°C中速震荡60分钟 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 转化 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 10-100?L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。 ①环形质粒数 （1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 ②质粒纯度 ①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ③CaCl2处理 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 （2）感受态细胞 （competent cells) 把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。 6. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro pa