人工种子.DOC

第七章 人工种子 第一节 人工种子概念与发展状况 自从1978年Murashige提出人工种子概念以来，1986年Redenbaugh等成功地利用藻酸钠包埋单个体细胞胚，生产人工种子。此后，他们成功地获得了胡萝卜、棉花、玉米、甘蓝、莴苣和苜蓿等的人工种子。在我国，人工种子的研究已列入重点攻关项目，并已取得明显进展。 所谓人工种子（Artificial seed），是指将细胞培养中形成的体细胞胚或不定芽包埋在能提供养分（人工胚乳）的胶囊里，再在胶囊外面包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（人工种皮），造成一种类似天然种子的结构。人工种子可在一定条件下萌发生长，形成完整植株。 与天然种子比较，人工种子有其自身特点：① 人工种子主要来源于体细胞胚，而体细胞胚是通过无性繁殖体系实现的，因而可以用于固定优良基因组合杂种优势，且稳定快；而优良基因组合杂种优势通过天然种子的有性繁殖，必然导致大量分离，难以稳定，使一些需要的特性丧失。② 由生物工程产生的转基因植株和植物组织与细胞培养筛选获得的突变体，通过体细胞胚发生制作人工种子迅速扩大繁殖，不受季节限制，可以大批量生产，提供充足种源，成本低，发芽速度和生长速度比较一致，体积小，运输方便，还可以直接播种和进行机械化操作等。③ 在制作人工种子过程中，加入农药、菌肥、激素等可以提高农作物抗病虫害的能力，加速作物生长和发育。 人工种子涉及的问题较多，主要是：① 要求高频率诱导体细胞胚发生，而且数量多、质量高；② 为使人工种子出苗整齐一致，必须使体细胞胚同步化；③ 人工种皮材料必须不损害体细胞胚，同时又有利于发芽和生长，并经得起加工、贮藏和运输；④ 人工胚乳必须保证体细胞胚正常发育和提供充足营养，同时能防腐和防干；⑤ 能够进行机械操作以便大量制种；⑥ 提高体细胞胚产生正常植株的转换率。由此可见，体细胞胚发生频率的高低、胚的质量和体细胞胚发生同步化是生产人工种子的基础和关键。 繁殖体种类 一、体细胞胚及其规模化生产 体细胞胚的诱导和形成需要经过至少两个阶段：第一阶段，在含高生长素浓度的培养基中，诱导胚性细胞形成；第二阶段，在较低生长素或无生长素的培养基中诱导体细胞胚形成。 二、微芽及其营养变态器官繁殖体的培养 一般只需一个培养程序，但有时为了增加繁殖体的数量，也需进行一定次数的继代。 三、微型变态器官及其芽繁殖体的培养 需要经过不同的诱导程序获得。 人工种子的研制 一、高质量和高产量体细胞胚诱导与同步化 人工种子必须以同步化、高质量和高产量的体细胞胚为基础。体细胞胚一定要活力强，能够正常发育并完成全部发育过程，诱导出的体细胞胚可以单个剥离，而且再生频率高，在长期继代培养中体细胞胚的发生和发育能力不丧失，并在激素等条件下可以同步控制体细胞胚胎发生。胡萝卜等工艺基础较好的植物，体细胞胚产量较高，1L培养基能分离出10万个体细胞胚。 根据有关研究，将体细胞胚诱导与同步化控制归纳如图5.11所示。 图5.11 体细胞胚诱导与同步化控制 二、 人工种子包埋 获得高质量和高产量且同步化的体细胞胚后，选择适合的材料进行包埋。包埋时应注意以下几点：① 包埋材料必须对体细胞胚无损害和无毒性，确保体细胞胚正常胚萌发的能力；② 人工种子在研制、贮藏、运输和种植过程中具有耐久性；③ 人工种子的胶囊内必须含有植物生长和发育所需要的养分、水分和植物激素；④ 人工种子适合机械化播种。 包埋方法：主要是滴注与装膜。藻酸盐所形成的胶囊是目前最好的凝胶包埋材料。 滴注是指将体细胞胚悬浮于含2%～3% 的藻酸钠溶液中，然后用塑料吸管吸住含体细胞胚的藻酸钠悬滴并置于0.1 mol/L CaCl2溶液中，经离子间发生交换而形成胶囊。胶囊的直径与吸管内径、吸注的速度、胶囊的大小、体细胞胚的大小和发芽能力有关。胶囊中体细胞胚的位置一般应偏在一边，以利于体细胞胚萌发。为保证体细胞胚萌发，聚合时间要适宜，聚合时间的长短与所用包埋试剂浓度密切相关。当藻酸钠浓度控制在2%～3% 时，在CaCl2中停留的时间不要超过10 min，否则胶囊会太硬而影响体细胞胚萌发。形成胶囊后转入无菌水中冲洗，最后在1/2 MS培养基上做发芽和转换试验，或进一步包裹人工种皮（沈大棱，1991）。 装膜法制备人工种子是指将体细胞胚混合到温度较高的胶液中，然后滴注到一个有小凹坑的微滴板上，随着温度降低变为凝胶而形成胶丸（崔凯荣，戴若兰，2000）。 三、人工种皮的研制 美国杜邦公司生产的Elvax4260是目前一种较好的人工种皮材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质共聚的产物。人工种皮的制作方法为：先将4 g藻酸钙胶囊置于20 mL含0.