“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案.pptVIP

* NOTE:质粒获得后，用限制性内切酶单酶切，使其线性化！ 或者使用纯化的PCR产物。 NOTE: 稀释液可采用专用的定量PCR稀释液，如EASY DILUTION 标准曲线的线性关系不佳可能的原因： 1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度； 2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融； 3.引物或探针不佳：重新设计； 4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。 PCR过程中经常出现的几个问题分析 Ct值出现过晚（30）： 阈值设计过高； 反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等； PCR各种反应成分的降解或加样量不够； 扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。 阴性对照出现明显的扩增： 荧光 PCR mix 或水被污染； 气溶胶的干扰； 引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析。 PCR结果的重复性不好： 加样不准确； 仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好； 模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。 扩增效率低： 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解； 反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法； 反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。 荧光定量PCR Ct值一般在多少后认为模板没扩增： 当进入对数期的循环数大于35时，Real time RT-PCR检测无效，基因没有表达； 当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少 3 个重复才能判断是否能检测到基因的表达。 The end！ Thank you！ 反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能 * 模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少，即Ct值越小 * 有文献表明某基因在给定研究条件下适合用作Housekeeping gene; 没有文献表明某基因在给定研究条件下不适合用作Housekeeping gene（特别是β-Actin和 GAPDH）;Housekeeping gene 在给定研究条件下的表达丰度最好与目标基因相似 实测多个备选Housekeeping gene, 以各备选基因的几何平均数为均一化标准，验各基因在给定条件下的表达稳定性 * 内参基因和目标基因的扩增效率接近- 正负10%; 内参基因(houskeeping gene)在相互比较的样本之间表达丰度相同 * 神经生物学科研中心 分子生物学平台 张宝乐 “从RNA提取到荧光定量PCR”的解决方案 一、RNA提取及反转录 样品收集 提取RNA 的样品要保证“新鲜” （屠宰后，立即放入液氮，过夜后转入-80℃冰箱） RNA提取 防止RNA酶的污染：DEPC处理 150-180 ℃烘烤3-4h Trizol-氯仿（氯仿-异戊醇49:1）-异丙醇-75%乙醇 试剂盒（离心柱滤膜吸附法） 提取方法： RNA 检测 甲醛变性电泳: 三条带（28、18、5.8/5S） 紫外吸光值检测： OD260/280 (1.8-2.0) （＜1.7蛋白质或酚污染；＞2.1异硫氰酸残存或降解） OD260读数（0.1-0.5） (线性关系好) RNA得率=OD260*稀释倍数*40ng/μl 反转录 模版： 总RNA、mRNA、体外转录的RNA 引物: oligo（dT）、随机引物、基因特异引物(GSP) 反转录酶： 防止RNA二级结构导致的反转录失败： RNA 65℃ 5min，冰上3-5min，立即42℃反转录 加入氢氧化甲基汞（CH3HgOH）或解链蛋白 使用耐受高温（55-65℃）的反转录酶 反转录检测 利用内参基因检测反转录效果，如GAPDH, β-actin等。 利用普通PCR初筛定量引物 特异性、避免产生引物二聚体 产物长度