仪器分民析第四版第三章.pptVIP

高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高速：迅速 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 一、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC： 适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 占有机物的80% 2．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 3．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 又称 淋洗液、洗脱剂 对流动相的要求： 1）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、纯化 2）与固定液不反应，不引起柱效损失和保留特性变化 3）对样品有良好溶解度 k=1~10 k=2~5 最理想的 4）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学 §3-2高效液相色谱仪 液相色谱 二 高效液相色谱仪的主要部件 1．泵：输送流动相，提高柱前压力，获得高速液流 压力一般为15~35MPa 要求：流量稳定，压力平稳无脉动，流速可调 恒压泵：流量精度不稳，如气动放大泵 恒流泵：适用于梯度洗提，常用，如往复式柱塞泵 特点：不受整个色谱体系中其余部分阻力微变化的影响，连续供给恒定体积的流动相；流量可调；死体积小（适宜梯度洗提）； 缺点：输出有脉动（可用脉冲阻尼器或双泵头互补），对紫外检测器影响不大 优点：供给无脉冲、稳定流量的输出，适用于匀浆法填装色谱柱 缺点：液缸体积大，不适于频繁更换流动相；不适于梯度洗提；补充溶剂过程，避免出现色谱峰 2．洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 低压梯度 ：常压下预先按一定的程序将溶剂混合后用泵输入（外梯度） 高压梯度 ：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，混合后送入色谱柱 （内梯度） 3．进样装置 要求：将试样“浓缩”瞬时注入色谱柱上端柱担体的中心成一小点 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样，tR不精确（早期） 2）阀进样：不必停泵，六通阀 4．色谱柱：直径4~6mm，柱长10~30cm 填料粒度5~10μm 柱效评价：色谱系统适应性试验，R，n 影响因素：填料的性能 发展：减小填料颗粒度；减小柱径 填料方法： 干法（20 μm 以上） 湿法：匀浆法，以一合适的溶剂或混合溶剂作为分散介质，使填料微粒在介质中高度分散，形成匀浆，高压下将匀浆压入柱管中，制成均匀、紧密的高效柱 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 4．检测器 1）紫外光度检测器（最广泛）： 适于吸收紫外光的物质 原理：被分析试样组分对特定波长紫外线的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵循比尔定律 种类：固定波长（单波长和多波长）、可变波长 特点:灵敏度高，最小检测达10-9g·mL-1，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提 缺点：溶剂受限 荧光检测器：只能分析自身发光的物质 原理：具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光；或不发射荧光的物质通过化学衍生转变成能发出荧光的物质 3）示差折光检测器： 借连续测定流通池中溶液折射率的差别测定 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 ： 根据物质在某些介质中解离后所产生电导变化来测定解离物质含量 5）化学发光 6）蒸发光散射检测器 不挥