《蛋白质核酸沉淀分离技术》-课件设计（公开）.pptVIP

沉淀分离技术 沉淀和结晶的区别: 形态 成分纯度 结晶:同类分子或离子以规则排列形式析出； 沉淀:无序析出，纯度远低于结晶。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。 任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。 沉淀法操作步骤 ： ①加入沉淀剂。 ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取 优点：设备简单、成本低、原材料易得、 便于小批量生产； 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质， 或含有大量的盐类，或包裹着溶剂， 产品纯度常比结晶法低， 过滤也较困难。 eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。 沉淀法分离蛋白质的特点： 生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。 §3.2 蛋白质的溶解特性 蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。 §3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性 吸引力 §3.4 蛋白质沉淀方法 Salting-in 蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。 蛋白质聚集沉淀 选用盐析用盐的几点考虑： 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济 阴离子： 柠檬酸根-3酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS- 阳离子： Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+ Rb+NH4+K+Na+Li+ 常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。 （1）溶解度大 （2）分离效果好 （3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 （4）价格便宜，废液不污染环境。 优点 硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。 缺点 硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。 1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。 蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。 （1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活 加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。 聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、C