血清谷们丙转氨酶测定.pptVIP

血清中谷丙转氨酶的活力测定 【目的要求】 1. 掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2. 熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3. 了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。 原理 转氨作用：将α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移 到α-酮基上，生成相应的酮酸与氨基酸的反应。催化这 一反应的酶称为转氨酶。 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、 肾等组织中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT） 的活性均较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内两种 酶维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。 谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 谷草转氨酶 glutamic oxaloacetic transaminase GOT 当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿 胀、坏死导致大量的酶释放到血流中，从而引起血清谷 丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶(GOT)活性显著升高。因 此测定这些酶的活性对某些疾病的临床诊断具有重要的 参考价值。 本试验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物 (基质液成分)经血清谷丙转氨酶作用生成谷氨酸及丙酮酸。丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。反应过程如下： 0 COOH C O CH3 NO2 H2N HN NO2 COOH C CH3 NO2 N HN NO2 + 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙 棕红色，520nm处具特征光吸收，颜色深浅（OD520值）与丙酮酸含量成正比，可据此进行比色测定。 2，4-二硝基苯肼 COOH C NH2 CH3 COOH C O (CH2)2 COOH COOH C O CH3 COOH C NH2 (CH2)2 COOH + + 谷丙转氨酶 Ala Glu α-KG 丙酮酸 King氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在37℃ 与pH7.4的基质液作用60分钟，生成1umol丙酮酸为一个活力单位。临床检验取血清量为0.1，报告数据以100ml血清计算，因此实际侧得结果乘1000即可。 实验材料及试剂 实验材料：动物或人血清 实验试剂：丙酮酸标准液要求临用前配制； 四、实验操作 标准曲线的绘制 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 丙酮酸标准液，ml 基质液溶液，ml 磷酸缓冲液，ml 相当于酶活力卡门氏单位 0.00 0.50 0.10 0 0.05 0.45 0.10 28 0.10 0.40 0.10 57 0.15 0.35 0.10 97 0.20 0.30 0.10 150 0.25 0.25 0.10 200 2,4-二硝基苯肼 ml 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 37℃水浴保温 20min 氢氧化钠 ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 室温下静置10min 0号管调零，于520nm处测吸光度 GPT活力测定：洁净干燥试管2支， 即测定管、对照管各1支 试剂 测定管 对照管 血清， ml 基质液溶液， ml 0.1 0.5 ---- 0.5 37℃水浴30min 2,4-二硝基苯肼溶液， ml 血清， ml 0.5 ____ 0.5 0.1 37℃水浴20min 0.4mol/L氢氧化钠溶液， ml 5.0 5.0 室温下静置10min ，对照管调零，于520nm处测吸光度 ⑴、标准曲线的制作 以表1中的A520为纵坐标，酶活性单位为横坐标，绘 制标准曲线。 ⑵、样品中转氨酶活性的计算 根据样品管的A520查标准曲线，即得每100ml血清 转氨酶的活性单位数。 注意事项 1. 2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙 2. 吸量应准确，严格控制反应时间和温度。 3. 在测定GPT活力时，应事先将底物、血清在37℃水浴中恒温 4. 溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定结果。 5．在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释后再进行测定。 * 凡具有酮基的化合物均可与2，4-二硝基苯肼发生上述类似反应生成相应的苯腙。 底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标线时，需加