农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸-微生物学报.PDF

生 物 工 程 学 报 涂光伟 等/农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株 1063 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn July 25, 2015, 31(7): 1063−1072 DOI: 10.13345/j.cjb.140594 ©2015 Chin J Biotech, All rights reserved 研究报告 农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹 果酸高产菌株 1,2 1,2 1,2 1,2 3 1,2,4 涂光伟 ，王永康 ，冯骏 ，李晓荣 ，郭美锦 ，邹祥 1 西南大学药学院，重庆 400715 2 重庆药物过程与质量控制工程技术中心，重庆 400715 3 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237 4 重庆大学生物流变科学与技术教育部重点实验室，重庆 400044 涂光伟, 王永康, 冯骏, 等. 农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株. 生物工程学报, 2015, 31(7): 1063–1072. Tu GW, Wang YK, Feng J, et al. Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Aureobasidium pullulans and high-efficient screening for polymalic acid producing strain. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1063–1072. 摘 要: 建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及 T-DNA 突变库，高效筛选聚苹果酸高产菌株及功 能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉，抗性压力筛选及 PCR 验证建立根癌农杆 菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法，结合发酵液 pH 与聚苹果酸含量响应变化，微孔板高效筛选高产聚苹果酸 的 T-DNA 插入突变株，基因组步移确定 T-DNA 插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株，每 107 个细胞可获得 80−120 个转化子，出芽短梗霉 H27 号 T-DNA 突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高 24.5% ，基 因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方 法和 T-DNA 插入突变库，结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。 关键词: 农杆菌，出芽短梗霉，遗传转化，高效筛选，聚苹果酸 Received: December 1, 2014; Accepted: January 4, 2015 Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2015AA021005, 2014AA021205), Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. XDJK2013B039, 2362014XK07), Visiting Scholar Foundation of Key Laboratory of Biorheological Science and Technology (Chongqing University), Ministry of Education (No. CQKLBST-2014-006). Corresponding author: Xiang Zou.