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DNA测序技术 第一代：双脱氧末端终止法 化学降解法 第二代：DNA序列分析的自动化 第三代：新一代DNA测序技术 第一代 70年代末，Sanger发明双脱氧核苷酸末端终止法，到现在仍为绝大多数实验室常用的DNA序列分析方法。 同期，WalterGilbert发明化学降解法。 双脱氧末端终止法原理 2’端羟基被氢原子取代形成 dNTP 3’端羟基再次被氢原子取代形成 ddNTP 无论体内还是体外条件下的DNA合成反应，DNA聚合酶都是以单链DNA为模板，根据碱基互补配对原则，将适当的dNTP底物连接到事先已经与DNA单链模板结合的寡核苷酸引物的3’羟基末端，形成3’,5’-磷酸二酯键，同时脱去一个焦磷酸（PPi）分子；而新连接到引物上的dNTP底物又提供一个新的3’羟基末端，与下一个dNTP底物连接，以形成下一个3’,5’-磷酸二酯键，以此类推，从而使引物延伸下去最终合成一条与单链模板互补的完整新链 化学降解法 单侧末端标记的DNA片段在5组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段的位置。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。 第二代 双脱氧末端终止法操作简便、结果清晰可靠，一次能确定300-500个核苷酸序列，已成为最常用的DNA测序方法。在第二代DNA序列分析的自动化中仍沿用该原理。 化学降解法操作繁杂，所用的化学试剂多为有毒物质，且无法进行自动化分析，故在DNA序列分析中很少人用。 第二代 80年代中期，出现自动测序仪（应用双脱氧终止法原理）、荧光代替同位素，计算机图象识别 90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳 DNA序列分析的自动化原理 利用双脱氧末端终止法的原理，用四种不同的荧光化合物分别标记4种反应产物，把4种反应物混合在一起进行电泳，从而大大提高点用分析的效率，实现了DNA测序的高度自动化。 ABI型全自动DNA测序仪：其特点采用专利的4种荧光染料分别标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反应后，反应产物3’端（标记终止物法）或5’端（标记引物法）带有不同的荧光标记》一个样品的4个测序反应产物可在同一泳道内电泳，从而降低测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。通过电泳将各个荧光标记片段分开，同时激光检测器同步扫描，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像。电脑可在电泳过程中对仪器运行情况进行同步检测。结果能以电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种方式输出。 ALF全自动激光荧光DNA测序系统 :该系统采用非放射性的单一——Cy5荧光素标记测序引物。沿用双脱氧链终止法进行反应，分别生成4组终止于不同种类碱基、带有Cy5荧光素标记的DNA片段。A、G、C和T四组反应物在变形凝胶上电泳，每个泳道都有一个有激光枪和探测器组成的检测装置，当Cy5荧光素标记的DNA条带迁移至探测区并遇上激光时，荧光标记被激活并释放出光信号，光信号有探测器接收，最后电脑将收集到的信号进行处理。 在第二代测序技术中最新型自动测序仪为大规模毛细管DNA分析系统，采用涂层毛细管，使信噪比更高，有效提高分辨率，工作效率极大提高，在人类基因组测序和基因结构研究中发挥了十分重要的作用。 新一代DNA测序技术 ＊2005年：焦磷酸测序法（美国Roche Applied Science） ＊2007年：新一代高通量基因测序分析系统——SOLiD（美国应用生物系统公司） ＊最新成果：Illumina测序仪在单分子簇的边合成测序技术的基础上，采用了可逆终止化学反应。（美国Illumina公司和英国Solexa Technoiocy） 焦磷酸测序法 新一代高通量基因测序分析系统：SOLiD在进行测序反应时应用连接法和双碱基编码原理，他对每个碱基判读2次、用连接酶代替了传统的聚合酶、测序过程中更换引物。 Illumina测序仪：其在单分子簇的边合成边测序的基础上采用了可逆终止化学反应。Solexa技术保证了每次延伸反应时4种dNTP的浓度均匀，有效地避免了掺入错误。 新一代测序技术主要基于循环芯片测序法。它的Helicos单分子测序技术、SMRT技术和纳米孔单分子测序技术正向着更高通量、更低成本、更长读取的方向发展。其出现弥补了传统测序方法的缺陷，借助区数据产出通量高、测序成本低的显著优势，新一代测序技术为解决基因分子生物学问题开辟了新途径 临