静脉注射用治疗基因靶向传递系统义的分析.docx

四川大学博士掌位论文静脉注射用治疗基因靶向传递系统的研究 四川大学博士掌位论文 静脉注射用治疗基因靶向传递系统的研究 (摘要) 导 师：张志荣教授 博士研究生：孙 逊 随着人类基因组计划的完成和人类疾病相关基因的阐明，疾病的基 因治疗备受瞩目。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基 因传输系统。目前，基因传输系统主要分为病毒载体系统和非病毒载 体系统。病毒载体虽然具有较高的基因传递效率，但其临床应用存在 着毒性和免疫原性等问题。因此，非病毒载体系统的研究成为另一重 要的发展方向。非病毒载体具有使用方便、可大规模生产以及无免疫 原性等优点，其中阳离子脂质体是研究应用得最为广泛的非病毒载体。 但由于阳离子脂质体在体内的稳定性和靶向性较差，常常只能采取局 部注射的给药方式。 为了构建一种可供静脉内注射的、具有靶向传输作用的基因载体， 本文设计用由海洋鱼类提取的天然产物鱼精蛋白，作为聚阳离子材料 缩聚质粒DNA，再让脂质体与缩聚后的DNA相互作用，从而使脂质双层 重新排列，最终形成结构紧密的脂质一聚阳离子一DNA复合物 (Lipid-pol ycation—DNA complexes，LPD)。 本研究中我们利用微生物发酵的方法大量培养转化有质粒的大肠 杆菌，并采用阴离子柱层析的方法分离纯化质粒。采用紫外分光光度 法和凝胶电泳法对质粒的纯度和含量进行了测定，纯度符合要求。 我们建立了用荧光染料Hoechst 33258来测定制剂中DNA含量的 方法。采用薄膜一挤压法制备空白脂质体，然后与适量的鱼精蛋白一DNA 复合物在室温孵育后，得到LPD；分别用单因素法和中心组合法优化了 阳离子型LPD和阴离子型LPD的处方。 为了提高阳离予型LPD的物理化学及生物学稳定性，我们将其制 备成冻干针剂。冻干后的LPD可以保持其结构的完整性。冻干后的LPD 针剂外观饱满疏松，色泽均匀，表面细腻光洁，具有足够的强度；其粒 径为132．5rim，Zeta电位为44．35mV，包封率为93．61％，微粒的形态和 四jll大学博士学位论文pIi值无明显改变，而且再分散性良好。另外，阳离予LPI)经冻干后能 四jll大学博士学位论文 pIi值无明显改变，而且再分散性良好。另外，阳离予LPI)经冻干后能 保持其抗核酸酶能力和转染活性。 在体外细胞的转染实验中，我们以易于检测的报告基因为工具， 对我们构建的LPD在体外细胞中的表达效率与裸DNA和商品化脂质体 载体进行了比较研究。结果表明LPD在人肺癌A431细胞中的转染率为 36．25±5．02(mU／mg蛋白)，明显高于Lipofectamine，在人肝癌 SM’．4C一772I和HepG2细胞中的转染率分别为18．71±I．36和28．84± 3．62(mU／mg蛋白)；而裸DNA在各株细胞中的转染率均极低。 小鼠体内的转染实验表明，静脉注射裸质粒后，小鼠的心、肝、脾、 肺和肾五个脏器均未发现蓝染的阳性细胞；而静脉注射LPD冻干针剂 后，除心脏外，其它几个器官均有蓝染的阳性细胞，并且发现LacZ在 肺脏和脾脏有较强的表达，尤其是在肺的支气管上皮。 我们还进一步考察了阳离子LPD(pORE～miLl2)的抗肿瘤活性。在 C57BL／6d,鼠腋下接种LL2月ib癌细胞，构建小鼠的肺癌模型，尾静脉注 射阳离子LPD(pORF～mILl2)后，观察其抗肿瘤活性。初步实验表明， LPD与顺铂联合使用能提高疗效、降低顺铂的毒性、延长小鼠的生存期。 为了提高载基因脂质纳米粒的肝靶向性，我们利用肝细胞表面的 去唾液酸糖蛋白受体的识别作用，合成了一系列胆固醇的半乳糖衍生 物，制备了带有不同半乳糖配体的LPD转染系统，并用SMMC一7721和 HepG2细胞对这些化合物的肝细胞靶向性进行了筛选。结果表明，半乳 糖残基与其母体分子之间的空间距离(Spacer)，是ASGP—R识别半乳糖 配体的重要决定因素之一，我们所合成的化合物lc具有较优的肝细胞 革巴liq性。 本文研究结果表明，LPD是一种制备工艺简单、稳定性好、可供静 脉注射用的非病毒域体系统。通过调整LPD的表面电荷和用半乳糖配 体进行表面修饰等手段，可提高LPD的肺靶向性或肝靶向性。LPD在基 因给药系统巾的应用，值得我们的进一步探讨和深入。 关键词：基因治疗非病毒载体靶向传递报告基因白介素12 脂质一聚阳离子一DNA复合物 四jII太掌博士学位论文Study 四jII太掌博士学位论文 Study on the targetable and intravenous—injectable vectors for efficient gene delivery (Abstract) Advisor：Prof．Zhi-rong Zhang Ph．D．candidate：