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基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用 刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所 中心法则 复 转录 翻译 DNA RNA 蛋白质 蛋白 制 反转录 糖蛋白 脂蛋白 酶类 激素 细胞因子 基因重组技术 基因探针技术 基因重组药物 基因诊断 基因治疗 PKU 尿毒症（口服artificial cells) 基因诊断 运用基因探针， PCR技术等探测特定靶基因的存在与否，或是否有基因突变等缺陷，从而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。 基因型 表 型 基 临 血 生 细 影 病 因 床 清 化 菌 像 理 诊 学 学 学 学 学 断 诊 诊 诊 诊 诊 诊 断 断 断 断 断 断 基因诊断的特点 灵敏度高（早期） 特异性强 操作简便 取材大多不受组织器官限制 可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断 检测细菌内病毒等微生物时不需培养 聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction（PCR） Kary B. Mullis 1984 年问世, 成为分子生物学和生命科学发展史上的里程碑 1993 荣获诺贝尔奖 Mendocin 128号公路附近一棵七叶树下的突发奇想 专利官司之战: DuPont 与Cetus对薄公堂 PCR 原理示意图 PCR技术的应用 一、在分子生物学研究中的应用 二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 血友病、 地中海贫血、DMD、PKU等等 三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等 四、病毒 五、白血病、肿瘤 六、骨髓移植、器官移植供体配型选择 七、法医学 八、动植物学 九、古人类学、古生物学 PCR原理示意图 热变性：从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性4分钟，使之解为单链。 退火：然后置反应混合物于55℃，使引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。并迅速加入2单位耐热的Taq DNA聚合酶，混匀、离心10秒钟。为防止在整个PCR过程中，水份的蒸发影响PCR效果，通常加入35ul石蜡油封盖液面。 引物延伸：置上述反应混合物于70℃水浴中1-2分钟，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。结果，DNA拷贝数增加了一倍。 接着，将上述热变性—退火—引物延伸（称为一个循环）反复进行30-35次。只是热变性的时间缩短为1分钟左右。每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍（×2）。因此，如进行n次循环，则拷贝数将增加2n倍！进行25个循环，则拷贝数将增加225倍，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到特异性长度的扩增带。可见PCR之所以高速扩增的关键是因为每次新合成的DNA链在后来的循环中都可以作模板，犹如滚雪球，数量迅速增加。 如果引物5’端有几个与模板DNA不配对的碱基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对PCR效果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上限制酶的Linker，或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。 影响PCR效果的重要因素及注意事项： PCR技术的原理似乎非常简单明了，PC