抗tnf-α多价抗体的构建及等体内外生物学活性分析.docx

抗TNF．a多价抗体的构建及体内外生物学活性研究摘要 抗TNF．a多价抗体的构建及体内外生物学活性研究 摘要 肿瘤坏死因子q(n4F．a)是上世纪70年代发现的一个细胞因子，最初发现 它能引起某些特定的肿瘤组织的出血性坏死，现在已经知道它除了具有抗肿瘤作 用外，还在机体的免疫、炎症和病理中发挥重要的作用。1NF．a的拮抗剂包括中 和性的抗体已被证明是急性脓毒血症、类风湿关节炎，局部性回肠炎和牛皮癣等 急慢性炎症性疾病的有效治疗剂。美国FDA已批准了EtaⅡercept、Infliximab和 AdaliI肌mab这三种抗耵师．a的生物治疗剂，其中后两种为抗n4F-a的单克隆抗 体。抗体工程技术经历了鼠源杂交瘤抗体、人．鼠嵌合抗体、人源化抗体和人源 抗体的发展阶段，而上世纪80年代基因工程技术的兴起使构建基因工程的小分 予抗体如Fab、scFv及单域抗体等成为现实，这些小分子抗体由于分子量小、穿 透性强、易于构建并可在大肠杆菌等原核系统中功能性的表达而具有广阔的应用 前景。本研究通过基因工程的方法构建了具有中和活性的抗耵咿．a的单链抗体， 对其生物学活性进行了研究，并在此基础上对单链抗体进行了多价化，对多价抗 体的体内外生物活性进行了研究，为开发新的抗n婚。a治疗剂打下了基础。 一、抗TNF吨单链抗体TNF-龊h的构建及体外活性研究 单链抗体是一种将抗体的重链可变区(vH)和轻链可变区(vL)通过一段 连接肽连接起来而形成的重组蛋白。本研究利用连接肽(0GGGS)3将抗TNF．c【 的单克隆抗体Di62的Ⅶ和VL连接起来，设计成为完整的单链抗体的氨基酸 序列，然后根据设计的氨基酸序列以大肠杆菌偏爱的密码予将其反向翻译成编码 的DNA序列。根据编码的DNA序列，合成了22个寡核苷酸片段并用装配PcR 的方法将这22个寡核瞢酸片段拼接成的完整的单链抗体编码基因，在编码基因 的两端加上了克隆所需要的酶切位点。将此编码基因克隆进载体pTCM一2，通过 阳性克隆的鉴定和序列测定，构建了单链抗体1NF．scFv的表达载体，命名为 pTs。将载体pTs转化大肠杆菌BL21(DE3)star，利用0．4InM的IPl℃诱导目 中国协和医科大学博士学位论文 中国协和医科大学博士学位论文 中文摘要 的基因的表达，经SDS—PAGE和w醯oem．b1咖【iIlg分析目的蛋白的表达情况，单 链抗体主要以不可溶的包涵体形式在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占大肠 杆菌全菌蛋白的30％，占包涵体蛋白的50％。利用基于固定化Ni离子亲和层析 的人工分子伴侣辅助复性的方法对单链抗体耵4F-scFv包涵体蛋白进行了一步柱 上的复性和纯化，可得到76％以上的可溶蛋白，纯度在95％以上。对复性的单 链抗体n4F-∞Fv进行了体外活性研究。EusA试验表明单链抗体n4F_scFv能 与重组人n4F．a(rh．INF-a)发生特异性的结合；利用EuSA的方法分析了 1NF-ScFv对田羽F-a与其受体的结合的抑制作用，结果表明耵4F-scFv能有效的 抑制rhJ矾F-a与其受体的结合的结合，抑制l陷，m1的mn师．a与其受体的结合， 50％抑制的师-scFv的浓度大约为25峙，ml。MTT法分析了n师．scFv对1NF-n 细胞毒的中和作用，结果表明n眼scFv在体外能够有效的抑制n4F．a对鼠纤维 原细胞L929的细胞毒作用，抑制20功雠曲1NF-a的细胞毒活性，50％抑制时的 TNF-scFv的浓度大约为625n咖1。为了进～步证实．IT旧scFv的中和作用，利用 流式细胞术对n4F-scFv的中和作用进行了分析，发现niF．∞Fv能明显的抑制 rhn幢．a诱导L929细胞的凋亡，凋亡细胞在n谭．ScFv存在的条件下都明显的减 少且与rhlT4F．a呈现剂量依赖关系，以上结果表明单链抗体较好的保留了中和性 的单克隆抗体Di62的生物活性。 二、抗TNF-a多价抗体的构建及生物学活性研究 为了提高单链抗体的亲和力，我们构建了两种结构域不同的双价抗体和一种 四价抗体，并对它们的生物学活性进行了比较。通过PCR的方法从单链抗体表 达载体pTs中扩增带有黝d和肋，’lm的全长单链抗体编码基因，连接到载体 ∥山Mm—cD3的相应位点之间，即HsA连接肽的下游，构建成中间载体 pALMm_scFv。然后用鼢D地幻RI双酶切载体pTS，切下完整的单链抗体编码基 因，克隆到中间载体pAJ Mm．scFvI的相应位点之间，即HsA连接肽的上游，构 建成正向双价抗体(Sbi