抗凋亡蛋白c-flip泛素化降解机阳制的研究分析.docx

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：壶灶日 期： 逊垂丛霉．印园 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文 论文作者签名 期：逖蚴凹司 山东大学硕士学位论文目录 山东大学硕士学位论文 目录 摘{要 “1 符号说明 一6 前言 一8 】肿瘤 8 1．1肿瘤及肿瘤治疗 一8 1．2肺癌 一8 2细胞凋亡 9 2．1细胞凋亡概念 ·‘9 2．2生物学特征 10 2．3分子机制 10 2．4细胞凋亡与肿瘤 ‘12 2．5 caspase与细胞凋亡 13 3 c-FLIP ··· - 15 3．1肿瘤细胞中的c-FLIP ‘15 3．2 c．FLIP的作用机制 16 3．3 c-FLIP的泛素化降解 ’16 3．4靶向c．FLIP的抗肿瘤药物 ’17 4蛋白质泛素化降解 ’18 4．1泛素蛋白酶体途径 ’18 5泛素连接酶 ’20 5．1含有HECT结构域的E3s ‘21 5．2含有RING指状结构域的E3s ～2l 5．3含有U．box结构域的E3s ‘21 6 Cullin蛋白家族 一22 6．】Cullin蛋白复合体的结构 一22 6．2 Neddlation化的cullin家族蛋白 23 6．3 Cullin蛋白对底物的识别 ·‘23 i 山东大学硕士学位论文7 山东大学硕士学位论文 7 BTB蛋白家族 ·23 7．1 BTB结构域 23 7．2 BACK结构域 ·24 7．3 BTB蛋白的分类 24 7．4 BBP蛋白家族 25 实验捌科和方法 26 l实验材料 ·26 2试剂和耗材 ·26 3仪器设备 ·27 4溶液和试剂配方 ·29 4．1细胞培养所用试剂和配方 29 4．2蛋白裂解所用试剂和配方 ·29 4．3蛋白免疫印迹所用试剂和配方 30 4．4质粒转化所用试剂和配方 33 4．5免疫共沉淀所用试剂和配方 33 5实验方法 ·34 5．1．细胞培养 34 5．2免疫共沉淀实验 ·35 5．3 Western Blot检测蛋白变化 36 5．4 RNAi抑制基因表达 ··38 5。5质粒构建 39 5．6质粒转染细胞 ·44 实验结果 46 l Cisplatin促进c-FLIP—L的降解并升高BTBD6． 46 2 BTBD6和c．FLIP．L相互结合 46 2．1免疫共沉淀验证c．FLIP．L与BTBD6结合在一起 ··46 2．2 BTBD6和c．FLIP在细胞内共定位 ··47 3．BTBD6能够诱导c．FLIP的降解 -·48 3．1过表达BTBD6能够诱导c．FLIP的降解 48 3．2 siRNA抑制BTBD6表达，诱导c．FLIP升高 ·49 4．BTBD6促进c．FLIP的泛素化降解 · ·························-·-49 4．1 BTBD6促进c．FLIP蛋白的泛素化 ， ‘‘‘ 49 山东大学硕士学位论文4．2 山东大学硕士学位论文 4．2 BTBD6与c-FLIP·L的caspaSe—like结构域相结合 ·50 5．Cullin3与BTBD6促进c—FLIP的泛素化降解及caSpaSe 8的切割 51 5．1 BTBD6通过BTB结构域与c．FLIP蛋白结合 ．5l 5．2 Cullin 3与BTBD6相互结合 52 5．3 Cullin 3能促进caSpase 8蛋白的切割活化 ··53 讨论 s4 附录 S9 剿 醯 山东大学硕士学位论文抗凋亡蛋白c．FLIP泛素化降解机制的研究 山东大学硕士学位论文 抗凋亡蛋白c．FLIP泛素化降解机制的研究 摘要 研究目的 全球癌症发病率和死亡人数迅猛上升，癌症是目前威胁人类生命健康的主要 病因。化学药物是治疗癌症的重要手段之一，因此寻找安全高效的化疗药物显得 尤为重要。但现有化疗药物的肿瘤靶向性差，对机体正常细胞的毒副作用强等特 点极大地限制了化学疗法的发展，因此寻找特异性抗肿瘤的药物作用靶点是化疗 发展的关键，也是科学界关注的热点。其中，死亡受体信号转导通路中的c．FLIP 是很有潜力的肿瘤治疗的新靶标。 肿瘤细胞过度表达凋亡抑制