高效液相色谱法教学课件【全】.pptVIP

复习 ①气液相相同与不同点(应用范围.流动相作用) ②组份分离的影响因素(热力学.动力学) ③组分分离关键---迁移速度 ④色谱的保留作用 ⑤色谱图特点 ⑥柱效 N－与柱长无关 H－优点、物理意义 液相速率方程式,引入意义, 峰扩展－平衡分配次数 柱内峰扩展种类 分离度影响因素 分离条件摸索步骤 仪器 工作原理，各部分功能 泵：往复式柱塞泵工作原理 单向阀的作用 脉动原因 柱：组成、设计要求、柱效影响因素 二极管阵列检测器作用 紫外检测器（波长，样品） 液固吸附色谱(正相): 分离对象、固定相、流动相 影响因素：流动相（洗脱强度）、组分 填料类型（薄壳型、球型）特点 硅胶特点、活性控制 反相键合相色谱: 分离对象、固定相、流动相、优缺点 梯度洗脱（定义、样品） 影响组分保留的因素： 固定相、流动相、溶质 离子交换色谱： 原理 离子交换剂：命名，pH如何影响交换容量 影响保留因素： 不同pKa组分，pH如何影响其保留 调节离子强度:（Na2SO4、NaNO3) 离子抑制法－定义 pH→分子浓度→保留大小 离子对色谱法 原理（反相） 影响保留的因素： 极性、离子强度、PH 离子对试剂的选择 体积排阻色谱 原理：校正曲线 凝胶： 选择 要求 实验技术 常用定性分析方法 定量分析注意点 样品制备:回收率测定目的 柱的保养 流动相使用 制备色谱 再找图 本级标题去掉边框，后面的二级标题可继续保留边框。 本级标题去掉边框，后面的二级标题可继续保留边框。 一、分子量 对于分子量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。 分子量在200～2000的化合物，可用液固吸附、键合相色谱和离子交换色谱法。 分子量高于2000，则可用排阻色谱法。 二、溶解度 水溶性样品最好用离子交换色谱法和离子对色谱法； 微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法； 油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。 三、化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，可首先考虑用离子交换色谱。 异构体的分离可用液固色谱法； 同系物可用反相键合相色谱法； 对于高分子聚合物，可用体积排阻色谱法 小结: a.已知结构试样→查阅文献资料→以其他色谱分离技术作参考 b.分子量较大（M＞2000）蛋白质、高聚物→凝胶色谱法 c.分子量较小（ M＜2000）试样→多种溶剂中溶解度情况决定分离类型、填料、流动相 由于试样组分的复杂性，还需对试样的来源、性质等作详细了解，以作选择参考。 分离类型选择 应用 目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离和分析与生物医学有关的大分子和离子型物质，各种高分子化合物和不稳定化合物。 例如：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、合成聚合物、瞟吟、维生素、除锈剂、防老剂等等。 农药的分析 第六章、实验技术和辅助实验技术 §6－1 定性和定量分析 一、定性分析 ①利用保留值定性 a.与标准物对照 b.将标准物加入样品中 c.二极管阵列检测器 ②液相-质谱联用 ③收集洗脱液后定性分析 二、定量分析 ①标准曲线法（外标法） 是一种简便、快速的绝对定量方法。 步骤： 用标准样品配制成不同浓度的标准溶液，准确进样，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线。将被测组分在相同的色谱条件下进样，由峰面积或峰高根据标准曲线确定其浓度 特点： ①适用于大量分析　　②色谱条件完全相同 ②归一化法（所有组分都出峰,并在检测器上都 有信号） ③内标法（选取合适内标物。准确度，精密度 较好） ④标准加入法（加入标准样品，利用加入 前后峰面积变化计算） 三、影响定量分析结果准确度因素 ①样品制备 a. 样品溶剂与洗脱液互溶性好 b. 将干扰组分尽可能分离 c.含量低时必须富集 回收率试验：标准物加入到已知含量被测样 品中→用制备样品同样方法处理→定量 测定，得回收率。 回收率＝（测定值－样品值）/加入量 目的：检验被测组分在制备中是否100%定 量转化 储存条件：低温、干燥、避光 样品制备方法：a.溶解（超声波、离心） b.浓缩 c. 萃取 d.预分离 e.衍生化 ②进样技术 影响因素：a.进样装置的准确度和精度 b.分析人员对进样技术的熟练程度 进样－