生物化学对和分子生物学3.pptVIP

重组DNA技术 DNA重组的基本模式 (分)------目的基因及载体的分离 化学合成 基因组文库 cDNA文库 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR） 载体DNA的选择 质粒载体的一般结构 切------限制性内切酶酶切 载体和目的基因的切断 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 接------载体和目的基因的连接 （二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。 （三）人工接头连接法： 将人工连接器（linker,即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子DNA片段,约10~20个核苷酸， ）连接到平末端DNA分子(载体和目的基因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。 转------重组体的转化 宿主菌或受体细胞 感受态细胞（competent cell） 真核细胞的转染 重组体克隆的筛选与鉴定 阳性重组子的筛选与鉴定 1、遗传检测法(根据重组载体的标志作筛选) ------插入失活法 ------α-互补法 2. 限制性酶切法 3. PCR法 4.杂交筛选法 5.免疫学方 法 6. 核苷酸序列测定法 遗传检测法 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端１４６个氨基酸偏码区（全长1201氨基酸） 。这个编码区中插入一个多克隆位点。 受体菌是Z基因突变型，只含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，在IPTG （异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导下合成β－半乳糖苷酶N端片断,和受体菌的C端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的β－半乳糖苷酶,称α互补。 具有α互补的细菌培养在含IPTG及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的培养基上. X-gal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。 IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。 限制性酶切法 杂交筛选法 免疫化学检测法 DNA序列分析法 外源基因在宿主细胞中的表达 原核生物基因结构和表达特点 影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 基因工程用于生产蛋白质类药物 治疗糖尿病的胰岛素，是一种 51 个氨基酸残基组成的蛋白质 1982 年美国 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。 干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。 1 升发酵液中所得的干扰素相当于过去从 1000 升人血中所得。生产成本也大为降低。 目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物，现在用基因工程办法便可能大量生产。 PCR法 利用的目标引物(例如分离目的基因所使用的引物), 抽提需要筛选的克隆的重组DNA作为模板, 进行PCR扩增,根据是否扩增出目的片段来确定阳性克隆. 为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法 分子杂交 依据：碱基互补配对原则 ①合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记） ②升高温度或改变pH使DNA变性 ③分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。 步骤： 滤膜（固定抗体） + 该方法通常是用在目的基因筛选