第七章 核酶工程.ppt

第七章 核酶工程 近年来，酶学与其他学科交叉和渗透十分活跃，其研究领域得到了进一步扩展。 1873年发现第一个酶开始，经历了很长时间，在1936年得到结晶酶，才认识到酶是蛋白质。 1983—1986年已经认识到有些酶是由核酸组成，酶催化的本质是RNA。 例如核糖核酸酶，磷酸果糖激酶等 　原生动物四膜虫rRNA作用 加工成成熟的26S rRNA. 82年研究发现: (1)? 四膜虫rRNA前体有6400个核苷酸，其中有两个外显子和一个内含子, 成熟过程是内含子切除，两个外显子连接成成熟的rRNA，这个过程称为剪接。 这个剪接过程不需要别的酶参与催化，不需要ATP等提供能源，靠5’-GMP、Mg2+参与。这种 rRNA 前体自我剪接功能的特性，排除了任何蛋白质的催化作用。 但当时有争议： 1）它只是自身催化，而不能催化其他分子反应。 2）一般意义上的酶催化剂在反应前后应该没有变化。而在rRNA前体成为成熟的rRNA，切去内含子后，它不再有催化能力。 如(1)?四膜虫前体rRNA在低浓度阳离子下，切去一个内含子，余下部分连成成熟的rRNA，这种自我剪接是靠自己的前体rRNA。 rRNA自我剪接的前体加工功能与自身的结构有关。 而且还发现高温、内含子互补的核苷酸序列、高浓度的变性剂等可以使之丧失自我剪接的加工功能。 ? 进一步的研究发现，这种自我的剪接以后释放出来的内含子可以通过转磷酸酯反应自我环化。 5’-G-IVS-G-3’(414nt) ? 去5’-GA-(15nt)- + 成环 (399nt) ? 去5’-4nt + 开环 (395nt) 开环后无法再环化 线状395nt (称为L-19IVS) L-19IVS分子缺少内催化功能。但可以催化其他RNA分子 a. 转核苷酸作用 b. 水解作用 c. 转磷酸作用 d. 去磷酸作用 e. RNA限制性内切酶作用 e作用时用天然和人工合成的RNA底物都有相同的结果。 RNA内切酶与DNA内切酶作用一样，底物不同。 实验： 发现RNA催化剂的活性部位含多聚 GMP，其作用是催化剂和底物形成非共价键而发挥作用。 其催化中心是5’—GCAGGG—3’，L-19IVS中395个核苷酸 3’-过碘消去G 加入G 　　失去催化活性 活性又有了 如用点突变法作成5’-GCAGGG--,--GGCGGG-等一系列人工催化剂，可以限制性的水解相应的底物，表明不同催化剂的活性部位催化所对应的底物。 天然与人工RNA催化剂的底物专一性 RNA催化剂 （线状394nt RNA的22～27） 底物 产物 5’ 3’ I（5’ 3’） II ? GGCCU CUA5（1） GGCCUCU＋GA5 ? GGCCU GUA5（2） G -------- ? -GGAGGG- GGCC GCUA5 （3） ------- ? (1) ------- ? -G CAGGG- (2) G GGCCUGU＋ GA5 (3) ------ ? (1) ------ ? -GG CGGG- (2) G ------ ? (3) GGCCGCU＋ GA5 ? 通过这些研究，已经知道RNA催化剂的活性 部位及其底物专一性。 RNA催化剂的这个特性，由人工制造出一系 列新的催化剂，不断扩大其应用领域。