gfp融合的甲基对硫磷水解酶基因mph在E.coli中的表达.PDFVIP

第４１卷第１期 湖北大学学报(自然科学版) Ｖｏｌ.４１　 Ｎｏ.１　 ２０１９年１月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ) Ｊａｎ. ꎬ２０１９　 文章编号:１０００ ２３７５(２０１９)０１ ００２２ ０４ ｇｆｐ 融合的甲基对硫磷水解酶基因ｍｐｈ 在Ｅ.ｃｏｌｉ 中的表达 黄灿ꎬ程杨ꎬ马立新ꎬ严红 (湖北大学生命科学学院ꎬ湖北 武汉４３００６２) 摘要:依照大肠杆菌密码子的偏爱性将来源于Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.Ｍ６ 的有机磷水解酶基因ｍｐｈ设计合成了新的有机磷 水解酶基因ꎬ然后将其与ＧＦＰ融合进行表达ꎬ构建一株具有全细胞催化活性的大肠杆菌工程菌.设计优化后所合成的 ｍｐｈ￣ｒ基因全长９２７ ｂｐꎬ然后将基因克隆到ｐＥＴ２３ａ￣ｇｆｐ 大肠杆菌表达型质粒上ꎬ成功构建了重组表达质粒 ｐＥＴ２３ａ￣ｇｆｐ￣ ｍｐｈ￣ｒꎬ转化大肠杆菌感受态Ｒｏｓｅｔｔａ ｂｌｕｅ.经过诱导剂ＩＰＴＧ 的低温诱导２４ ｈ后ꎬ收集细胞ꎬ通过ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 检测融合蛋白的表达.实验结果显示ꎬ融合蛋白的表达量大大提高ꎬ且通过酶活分析测定ꎬ全细胞酶活达到了１１.２ Ｕ/ ｍＬ. 关键词:甲基对硫磷水解酶ꎻＧＦＰꎻｍｐｈ￣ｒ基因ꎻ融合蛋白 中图分类号:Ｑ８１４.９　 　 文献标志码:Ａ　 　 ＤＯＩ:１０.３９６９/ ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣２３７５.２０１９.０１.００５ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｐａｒａｔｈｉｏｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｇｆｐ ｉｎＥ.ｃｏｌｉ ＨＵＡＮＧ ＣａｎꎬＣＨＥＮＧ ＹａｎｇꎬＭＡ ＬｉｘｉｎꎬＹＡＮ Ｈｏｎｇ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨｕｂｅｉ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈａｎ４３００６２ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉꎬａ ｎｅｗ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｇｅｎｅ (ｍｐｈ)ｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.Ｍ６ ｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄꎬａｎｄ ｔｈｅｎｗａｓｆｕｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃ￣ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｆ ＧＦＰ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ Ｅ.ｃｏｌｉｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈｗｈｏｌｅ￣ｃｅｌｌｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｍｐｈ￣ｒｇｅｎｅｗａｓ９２７ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ２３ａ￣ｇｆｐ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ. Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２３ａ￣ｇｆｐ￣ｍｐｈ￣ｒ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ｂｌｕｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ＩＰＴＧꎬａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｒｅａｃｈｅｄ １１.２ Ｕ/ ｍＬ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:ｍｅｔｈｙｌ ｐａｒａｔｈｉｏｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅꎻＧＦＰꎻｍｐｈ￣ｒ ｇｅｎｅꎻｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ０　 引言 在上个世纪初ꎬ人们发现有机磷化合物能有效抑制生物体内的乙酰胆碱酯酶ꎬ从而表现出很好的杀 [１] 虫、灭鼠效果 .商品化的有机磷杀虫剂、灭鼠药自此诞生ꎬ在世界范围内被广泛且大量的使用ꎬ曾一度