基因编辑突变及SNP检测之Hi-TOM说明书（V1.6）.PDFVIP

基因编辑突变及SNP 检测之Hi-TOM 说明书 （V1.6 ） 刘庆，王春，焦晓真，王克剑 中国水稻研究所 2019 年1 月更新 一、工作原理 仅需两次普通 PCR 即可快速完成高通量测序文库的构建 （图1 ），并用配套的 Hi-TOM （/hi-tom/ ）在线工具自动解析高通量测序数据，理论每次可解析无限样品、无限位点， 检测包括SNP 分子标记及基因编辑突变在内的任何复杂序列信息，同时获得详细基因型信息。 二、主要优点 1、低门槛：傻瓜式通用设计，无需单独设计建库引物，无需生物信息背景，只需两次常规PCR ，即可 轻松完成建库，在线网站自动完成测序数据解析。 2 、无限量：可一次检测无限量样品、无限量位点。样品的数量以96 孔板样为基数 （图3 ），单次测序 可以同时检测96×M×N （M:表示混合96 孔板的数目；N :表示单个样品检测的位点数目）个靶位点。 3、用途广: 可检测任何复杂基因组 （如六倍体小麦等）的任何复杂基因编辑突变；结合多重PCR 也可 应用于SNP 等分子标记的高通量检测，用于基因定位或分子育种等。 4 、易用：具有简洁、友好的在线工具，只需简单的上传操作，就可以完成所有的信息分析工作，详细 的分析结果以邮件的形式回传。 5、稳定：已开发标准化的商业试剂盒，利用阿里云平台进行数据处理，经过一年多的反复调试优化， 目前运行稳定（网站已有大于20 万次的访问量，大于1 万次的数据分析量）。 6、便宜：与常规Sanger 测序相比，二代测序价格极其便宜 （1 G 数据量只需100 元左右，单次质检150 元左右）。 图1、Hi-TOM 流程示意图 图2、封面文章 参考文献：Liu Q, Wang C, Jiao X, Zhang H, Song L, Li Y, Gao C, Wang K. 2019. Hi-TOM: a platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. SCIENCE CHINA Life Sciences (DOI: 10.1007/s11427-018-9402-9 ) 1 三、操作步骤 1、 PCR 引物设计 根据常规PCR 引物设计原则进行引物设计（16-20 nt ）；靶点需在离左引物或者右引物的10-100 bp 范围 内。正向引物5’端加搭桥序列5’-ggagtgagtacggtgtgc-3’；反向引物5’端加搭桥序列5’-gagttggatgctggatgg-3’。 例 AGGTGAACGATGCGGGTGGCGCGCTGGCCGAAGACGTGTGCGCGGATGAGCCGGACGCCGAACAGAT GGCCATGGAGGAGGAGGAGGAGGCAGCCGACGTGCTGGAAGCAGAGGAGAGGATGGGTAAGTGTGT CGGAGGAGGATCAGCCGAGAAGGCTGC 正向引物 F: 5’-ggagtgagtacggtgtgcGTGAACGATGCGGGTGGCGCGCTG-3’ 反向引物 R: 5’-gagttggatgctggatggACACACTTACCCATCCTCTCCTCT-3’ 注：灰色底表示待检测的靶点序列，下划线为设计的PCR 特异引物序列。 2、第一轮PCR 扩增目的片段 利用引物进行常规PCR 扩增目的条带（多靶位点检测可进行多重PCR ）。PCR 结束后取3-5 µl 产物进 行电泳检测，确保扩出目标条带。 3、用Hi-TOM 试剂盒进行第二轮PCR，完成文库构建 （排枪加样，省力且防止混样） PCR 结束后取3-5 µl 产物进行电泳检测。第二轮PCR 产物比第一轮产物长100 bp 左右。 将第二轮PCR 产物混合，取混合后的PCR 产物，量根据样品的数量定，如混2*96=192 个样，可取200 µl 回收，大于4*96=