猪血中超氧化物歧化酶(so义d)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳.docxVIP

原理 超氧化物歧化酶（SOD） 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（O2 SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。 SOD催化下述反应：2H++2O2-→ H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内O2-的含量相对的平衡。机体内的O2-形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O 有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质 本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。 邻苯三酚自氧化法测定酶活力 酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生O2-，生成有颜色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在3～4 min内维持线性关系。加入酶液则抑制自氧化的速率，在 蛋白质含量测定 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250（Coomassic brilliant blue G-250）在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595 nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围在1～1 000 μg。 SOD同工酶分离鉴定 SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素（FAD）经光照所产生的O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD出应显示为蓝色，而有 操作步骤 SOD的提取 [1] 取新鲜猪血20ml于50ml离心管，6000r/min，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/min，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，6000r/min，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。 [2] 向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/min，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样500ul（样1）。然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却到室温，4000r/min，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样500ul（样2）。 [3] 向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置过夜，6000r/min，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，溶于3 ml蒸馏水，备用（样3）。 SOD活力测定 [1] 邻苯三酚自氧化率的测定 取4.5 ml 50 mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2 ml蒸馏水和1 ml 10 mmol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20 min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3 ml，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯内，用10 mmol/L HCl作空白，325 nm波长下每隔30 s记录光吸收值一次，整个操作在4 min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸光值变化控制在0.070/min左右。 [2] 酶活力测定 样1、样2及样3中SOD酶活力测定操作与[1]基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。 [3] 酶活性单位计算 根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性： 单位活性（U/ml）= (Ao-A 其中，Ao为邻苯三酚自氧化率；A 总活性(U)＝单位活性×酶原液总体积 [4] 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）