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SSR标记技术和ISSR 标记技术 雷世勇 　 2.1 SSR 标记技术。 在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列,如重复单位长度在15～65 个核苷酸的小卫星DNA ,重复单位长度在2～6 个核苷酸的微卫星DNA。 小卫星和微卫星DNA 分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成丰富的长度多态性。 定义：SSR （全称为简单序列长度多态性标记）也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为1～5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR 反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同,因而扩增出不同长度的PCR 产物,这是检测DNA 多态性的一种有效方法。 微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般为共显性,因此是一类很好的分子标记。 SSR分子标记的应用举例——鹅掌楸种属及杂种的分子标记 北美鹅掌楸EST序列中开发的EST-SSR引物 引物筛选 物种特异性扩增 引物特异性验证 SSR 标记技术的特点有： （1）数量丰富，广泛分布于整个基因组； （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。 SSR 标记的应用 目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱。 这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域。 2.2 ISSR 标记技术 ISSR 即（内部简单重复序列）,是一种新兴的分子标记技术。它是建立在1994年发展的一种微卫星基础上的分子标记。已经广泛应用于各种动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性的研究等方面。 几个重要的名词： ISSR：他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火,从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增。这类标记又被称为 ASSR或AMP-PCR。 RAMP: 在所用的两翼引物中,可以一个是ASSR 引物,另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR 引物,另一个是随机引物,则被称为RAMP 技术 。 ISSR分子标记的优点 2实验成本低； 3操作简单； 4实验稳定性高； 5物种间通用； 6多态性较高； 1记录方便； 7精确度高； 8检测方便； 9开发费用低。 ISSR 标记技术原理： 用于ISSR-PCR 扩增的引物通常为16～18 个碱基序列,由1～4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR 的5′或3′末端结合,通过PCR 反应扩增SSR 之间的DNA 片段。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR 可以检测基因组许多位点的差异。 ISSR的应用举例——攀枝花苏铁遗传多样性的ISSR分析 PCR扩增及产物检测： 从所有引物中筛选出扩增条带晰、稳定性好、特异性强的引物对48个DNA 样品进行PCR扩增。 引物筛选：从100个ISSR引物中筛选出扩增产物条带清晰的13条引物。 遗传多样性分析： 筛选出的13条引物共产生104条清晰条带，其中多态性条带94条，多态百分率为90.38% ，平均每个引物扩增条带数为8条。结果显示，ISSR分子标记对攀枝花苏铁多样性的研究效果很好。 第三代分子标记技术 章丽 SNP的检测方法 测序法 酶切法 荧光PCR法 DNA芯片法 质谱法 分子标记技术的应用 张文青 丛峰 遗传多样性（genetic diversity）一般指品种间及品种内个体在DNA水平上的差异。 通过对遗传多样性的评估，可以了解品种的遗传结构及遗传关系。在经济动物育