伪狂犬病毒多肽抗体的制备及神经元体外培养研究预防兽医专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文2．2．7体外培养鸡胚脊髓背根神经元及新生小鼠海马神经元的间接免疫荧 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 2．2．7体外培养鸡胚脊髓背根神经元及新生小鼠海马神经元的间接免疫荧 光检测 25 2．2．8微流体系统的组装及细胞培养 25 2．2．9微流体系统接毒 26 第3章结果与分析 ．．27 3．1 PRV RFP．UL21中间转移质粒的构建与鉴定 27 3．2伪狂犬病毒gB、VP26、VPl6蛋白的长耳兔高免血清的检测 ．．29 3．3新生小鼠海马神经元及鸡胚脊髓背根神经元的原代培养 30 3．4新生小鼠海马神经元及鸡胚脊髓背根神经元的间接免疫荧光 3 1 3．5原代培养的神经元攻毒后的间接免疫荧光 32 3．6微流体系统的组装 33 3．7微流体系统中原代培养DRG细胞及攻毒 34 第4章讨论和结论 ．．36 4．1新生小鼠海马神经元的原代培养 一36 4．2多克隆抗体的制备 ．．37 4．3多克隆抗体在间接免疫荧光中的使用 ．．37 4．4 PRV UL21蛋白对PRV在轴突运输中的影响 37 4．5微流体系统的使用 一38 4．6结{仑 ．39 参考文献 40 致谢 ．．46 II 万方数据 伪狂犬病毒多肽抗体的制备及神经元体外培研究摘要 伪狂犬病毒多肽抗体的制备及神经元体外培研究 摘要 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是猪0【疱疹病毒。PRV侵入外周神经 系统并在其中建立可再激活的感染。病毒通过轴突进入细胞核后(逆向运输)，病 毒基因一般在细胞核内建立潜伏感染。经过数月甚至数年之后，潜伏感染可以再次 被激活，产生新组装的病毒颗粒。随后病毒又运输至外周神经系统(顺向运输)， 在外周神经系统附近再次感染的上皮细胞会产生感染性的病毒颗粒来感染幼小的 宿主。病毒颗粒长距离的顺向和逆向的运动需要依赖轴突中微管的快速运输机制。 PRV通过受体介导膜融合进入轴突，这个时候病毒分离为病毒囊膜、糖蛋白、外层 被膜蛋白和内层被膜蛋白。有一些病毒成分在轴突中是单独运输的，这种运输影响 细胞内的潜伏性感染或者增殖性感染。 为了能更进一步的研究PRV在神经细胞与上皮细胞之间的方向性传输，Ch’ng 和Enquist发明了三室培养系统(triple—chamber system)，这种系统将神经元细胞体 与轴突通过物理性的隔离而隔开。随后又出现了另外一种不同于三室培养系统的微 流体系统(microfluidic chamber system)，可以被用做研究0c疱疹病毒的蛋白对病毒 在神经细胞轴突运输中的影响。 由以上研究背景，本试验通过设计多肽并注射到长耳兔，从而获得PRV gB、 VPl6、VP26蛋白的高免血清。分离并培养鸡胚脊髓背根神经元和新生小鼠海马神 经细胞。在微流体系统(microfluidic chamber system)中体外原代培养鸡胚脊髓背 根神经元，在轴突端或者胞体端接种PRV AUL21．EGFP重组病毒。在一定时间内收 获轴突端和胞体端的培养基，并分别测其毒价。通过分析轴突端和胞体端样品毒价 从而确定PRV被膜蛋白UL21在轴突顺行及逆行运输的作用。主要工作包括： 1．多抗的制备 根据gB、VPl6、VP26蛋白的氨基酸序列，找出一段适合的序列设计多肽。 将设计的多肽序列送公司合成。合成好的多肽溶液与弗氏佐剂混合注射至新西兰 长耳兔。免疫数次后用ELISA检测血清的效价，达到要求后，对长耳兔进行颈动 脉采血。对血液进行离心并吸取上清，上清即为所需的血清。Western blot检测所 得到的血清。经过检测后，这三种血清均含有相应蛋白的抗体。 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文小鼠海马神经元的原代培养 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 小鼠海马神经元的原代培养 选取出生24 h以内的新生小鼠，在解剖显微镜下分离获取脑部的海马组织。 用即配的浓度为2 mg／m-1木瓜蛋白酶消化成单个的细胞，接种在六孔板或者小皿 中，每三天换液一次，一次更换三分之一，每次换液需提前预热培养基。培养10 天左右进行观察。通过间接免疫荧光验证所培养的细胞为小鼠海马神经元．。 3．微流体系统的建立及重组病毒的接种 使用微流体系统(microfluidic chamber system)进行鸡胚脊髓背根神经元的原 代培养，神经元种植在微流体系统的一个室(胞体室)中，轴突通过细微纹沟伸展 至另一个室(轴突室)中。鸡胚脊髓背根神经元在胞体室中培养5 d后轴突即可通 过细微纹管生长至轴突室中。将构建好的重组病毒按一定的MOI接入轴突室或胞 体室，在一定的时间点测定轴突室和胞体室的毒价。结果表明微流体系统能够很好 地研究伪狂犬病毒逆行和顺行运输过