孕激素对人子宫内膜上皮细胞FUT7sLeX表达调控作用的研究.docVIP

FILENAME chinese_format.doc PAGE - 孕激素对人子宫内膜上皮细胞FUT7/sLeX表达调控作用的研究本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号： 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20060161001）的资助。 秦华民1，刘帅1，杨雪松1，燕秋1 1大连医科大学生物化学与分子生物学教研室，辽宁大连 (116044) E-mail： HYPERLINK mailto:*******@ yanqiu63@126.com 摘 要： 胚胎着床是一个复杂的动态生理过程，由胚胎与子宫内膜上皮细胞之间的黏附而启动。着床窗口期，胚泡表面表达L -选凝素，与内膜表面表达的唾液酸化Lewis X(sLeX)黏附介导母胎之间识别。岩藻糖基转移酶(fucosyltranferases, FUTs)参与Lewis寡糖抗原合成，其中，FUT7作用在α2，3唾液酸化的多聚乳糖胺的末端N-乙酰葡糖胺，特异催化合成sLeX表位。 本研究利用人子宫内膜上皮细胞(RL95-2)和人胚胎细胞(JAR)组成的体外着床模型，采用RT-PCR、间接免疫荧光及Western blot 等方法检测不同浓度孕激素作用下的RL95-2细胞FUT7和sLeX表达的变化，探讨在着床过程中孕激素对FUT7及sLeX调控的作用机理。 结果表明，孕激素以剂量依赖方式上调人子宫内膜上皮细胞FUT7和sLeX的表达，浓度在10-5mol/l作用最强。另外，孕激素增加胚胎细胞JAR与子宫内膜上皮细胞的黏附率，而孕激素拮抗剂米非司酮(RU486)对其有抑制作用。结果提示孕激素通过上调FUT7的表达，使子宫内膜上皮细胞合成的sLeX寡糖抗原增多，从而促进胚胎细胞和子宫内膜上皮的黏附，参与着床网络的调控。; 关键词：孕激素；FUT7；sLeX；子宫内膜；着床 中图分类号：Q5 生物化学 1．引言 随着糖生物学的发展, 人们发现细胞表面的糖作为一种信息分子, 在机体内参与了重要的生理过程, 如精卵识别、淋巴细胞归巢、细菌与宿主细胞之间的黏附、炎症反应以及胚胎着床等都有特异的糖分子参与其中[1]。近年来发现在哺乳动物着床期间, 其子宫内膜上皮表面有丰富的岩藻糖化寡糖，包括H1、H2、LeX、LeY、Lea、Leb和sLeX等[2,3]。sLeX寡糖抗原在小鼠胚胎着床过程中，母-胎界面的黏附和识别中起中介作用。岩藻糖化抗原在子宫内膜上皮细胞表面的表达受到卵巢激素的调节,但其作用方式和机理尚不清楚。 合成岩藻糖化寡糖的关键酶岩藻糖基转移酶(fucosyltranferases, FUTs)。至今为止,已经有9种岩藻糖基转移酶基因被克隆,分别是α1，2FUT(FUT1和FUT2); α1，3FUT(FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7和FUT9)和α1，6FUT( FUT8)。 岩藻糖基转移酶家族的FUT7属于?1,3-FUT，为sLeX寡糖末端糖链合成的关键酶 [4,5]，此酶位于9号染色体上，主要分布在脑和白细胞中，定位于细胞内高尔基体膜上，呈Ⅱ型膜蛋白拓扑学结构，由四个结构域构成，分别为胞浆区，跨膜区，茎部结构域和催化结构域[6]。该酶的表达变化可以反映寡糖的含量及表达水平。Olga D.Genbacev等人发现sLeX寡糖作为多种选凝素的配体，其与选凝素间的相互作用不仅是肿瘤转移的启动机制，而且在与其过程相似的胚胎着床过程，尤其是胚胎与子宫内膜的识别和黏附过程起重要作用[7]。因此推测其合成关键酶FUT7在着床过程中起重要作用。 孕激素可以调节子宫内膜和胚胎的细胞分化，影响母胎生理状态和胚胎着床的局部微环境，在围着床期发挥重要的生理功能。已有报道表明子宫内膜寡糖抗原的表达受孕激素调节[8-10], 卵巢孕激素对糖基转移酶基因表达的影响可能是激素对着床调节网络调控中的一个关键环节。 本研究通过半定量RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光等方法分析了不同浓度孕激素及孕激素拮抗剂米非司酮作用下人子宫内膜上皮细胞系RL95-2的FUT7基因表达情况，及对JAR细胞和RL95-2细胞黏附情况的影响。 2．材料与方法 2.1细胞培养 RL95-2细胞在DMEM/F12(1:1)的培养基(含10%胎牛血清，10mmol/lHEPERS, 5g/ml胰岛素，100IU/ml青霉素，和100g/ml链霉素)中培养。37℃, 5% CO2,饱和湿度条件下培养。每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞生长状况。在细胞生长对数期，消化离心后重悬，细胞计数为1×106个/ml,接种于六孔培养板，待细胞长满后，加入无血清的培养基24小时。在不同孔中分别加入孕激素，其终浓度分别为10-5mol/l, 10-6mol/l, 10-7mol