不同生境鱼类hif1α基因的克隆和差异性分析水生生物学专业论文.docxVIP

摘要缺氧可引起细胞产生一系列的代偿性变化，如呼吸量增加，HIF．1感受调节性加强、 摘要 缺氧可引起细胞产生一系列的代偿性变化，如呼吸量增加，HIF．1感受调节性加强、 红细胞适应性增多、肌红蛋白增加等。其中低氧诱导因子．1(Hypoxia inducible factor-1， HIF-1)的作用十分广泛，现已知HIF．1能够调控基因下游的60多种靶基因，是调节氧 稳态的重要转录因子。HIF．1由活性亚基HIF．1a和组成性亚基HIF．1B组成，活性亚基 HIF-la，在低氧调节中起着关键性的作用。弄清不同生境鱼类HIF-1a的序列变异和进 化，对于理解分子序列变异和低氧适应之间的相关性具有重要的意义，也可为培育和筛 选耐低氧鱼类品种提供理论依据。 本研究采用分子生物学方法，选择不同生境代表性鱼类为研究对象，对所选鱼类 银鲫(Cassius auratus gibelio)、淇河鲫(ossf”s auratus pengzesis)、鲶鱼(Silurns asotus)、 泥鳅(Paramis gurnus)，从其心脏、肝脏、肾脏、腮、肌肉中提取总RNA为模板，用 RT-PCR方法扩增出cDNA序列，并进行克隆测序。引物设计主要是基于鱼类HIF-1a 的保守性序列，设计和筛选一对特异性引物(上游引物加入Hin刎曰酶切位点，下游引 物加入Xho，酶切位点)扩增出银鲫、淇河鲫、鲶鱼、泥鳅的丘汐一-仅的编码序列。 将剧耳-序列经TA连接插入到pMD 1 9．T Simple Vector克隆载体中，转化大肠杆菌 JMl09，获得重组的pMD 19-T-HIF．1a高效克隆载体。用蓝白斑筛选，质粒PCR方法 筛选出阳性克隆，用HindlII$1 Not I酶切鉴定重组质粒。经测序以及同源序列的比对， 以验证所获得的鱼类HIF-1 Q eDNA序列。其研究结果如下： 银鲫H1F-lacDNA序列，长度2325bp，编码774个氨基酸。银鲫与彭泽鲫具有最 高的核酸序列一致性达到95％，其次是鲤鱼(Cypnnus carpio)95％，青海湖裸鲤 (Gymnocypris przewalskii)93％，白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)9 1％，团头鲂 (Megalobrama amblycephala)9 1％，草鱼(Ctenopharyngodon idellus)9 1％，麦穗鱼 (Pseudorosboraparva)90％，斑马鱼(Danio rerio)89％。通过保守结构域分析，其具 有bHLH结构域，PAS．A结构域，PAS．B结构域，C．TAD保守结构域和氧依赖降解区 (Oxygen dependent degradation domain，ODD)。银鲫HIF-1a在各组织中均有分布，但 其表达具有组织特异性，在心脏，鳃，肾脏中表达量较高，而在肝脏中表达量均较低。 淇河鲫与银鲫丘万一儿核酸序列相似度达97％，故二者有很高程度的类同。鲶鱼肌卜』6c的编码序列长2304bp，编码767个氨基酸。鲶鱼与斑点叉尾鲴(Ictalurus 淇河鲫与银鲫丘万一儿核酸序列相似度达97％，故二者有很高程度的类同。 鲶鱼肌卜』6c的编码序列长2304bp，编码767个氨基酸。鲶鱼与斑点叉尾鲴(Ictalurus punctatus)的核酸序列一致性达到90％，其次是胭脂鱼(Myxoeyprinus asiaticus)84％， 白鲢83％，草鱼83％，彭泽鲫82％。通过保守区域分析，其具有bHLH结构域，PAS—A结 构域，PAS-B结构域和转录激活区域C-TAD。 泥鳅HIF-la的编码序列长2316bp，编码771个氨基酸。泥鳅与鲢鱼的核酸序列同 源性达到85％，其次是胭脂鱼85％，草鱼85％，鲫鱼84％。通过保守区域分析，泥鳅 该序列具有PAS．A结构域，PAS．B结构域，bHLH结构域以及C．TAD。 本研究中，为了研究不同生境鱼类HIF-la的功能特点，克隆出鲫鱼、鲶鱼、泥鳅 的HIF-1a基因序列，分析发现：四种鱼类的HIF．10t的bHLH、PAS．A、PAS．B和C．TAD 区域高度保守，ODD和N．TAD区有一定程度的变异。银鲫和淇河鲫聚为一个系群，鲶 鱼和斑点叉尾鲴聚为一个系群，泥鳅独立出来，显然它们的进化速度差异较大。鱼类 HIF01a的进化速度较哺乳类和两栖类动物快，这与鱼类HIF-la的分布有一定关系。另 外，将银鲫的HIF-1a中ODD区剔除后，利用改造的HIF-1a基因，构建了重组质粒， 对于研究HIF-la基因及ODD区功能提供了条件和基础。 关键词：鱼，低氧诱导因子。la，cDNA序列，组织特异性 II ABSTRACTThe ABSTRACT The