植物微型反向重复转座子数据库p-mite的构建和烟草中t等mv侵染后无症状表型控制基因的遗传克隆.docx

华中农业大学2016届博士研究生学位论文1．4．5后续工作展望 华中农业大学2016届博士研究生学位论文 1．4．5后续工作展望 28 第二章利用RNA．seq和混合池分析法(BSA RNA)进行基因定位的方法开发 ．．30 2．1前言 ．30 2．1．1测序技术的发展 30 2．1．1．1第一代测序技术 30 2．1．1．2第二代测序技术 3l 2．1．1．2．1罗氏454测序 一32 2．1．1．2．2 Illumina Solexa测序 ．32 2．1．1．2．3 ABI SOLID测序技术 33 2．1．1．2．4 Ion torrent测序技术 33 2．1．1．3第三代测序技术 34 2．1．2第二代测序在基因组学研究中应用 34 2．1．2．1基因组测序和重测序 35 2．1．2．2 RNA．scq测序和Chip-seq测序 ．．35 2．13第二代测序在植物遗传学研究的应用 36 2．1．3．1 DNA分子标记的开发 ．36 2．1-3．2基因分型和高精度连锁图谱的构建 ．．36 2．1．3．3 目标基因的快速定位 37 2．2．1使用的软件和工具 39 2．2材料与方法 ．．39 2．1．4课题的由来和意义 39 2．2．2测试数据来源 4l 2-3结果与分析 ．．42 2．3．1 SNPMAPPER的原理和分析流程 42 2．3．2 SNFM=AFPER在定位单基因控制性状中的应用 ．．44 2．3．3 SNPMAPPER在定位数量性状(QTL)位点的应用 ．45 2-3．4 SNPMAPPER在具有复杂基因组物种中基因定位中的应用 46 2．4讨论 ．48 2．4．1第二代测序和BSA相结合的分析策略可以有效实现基因的快速定位 48 2．4．2进行BSA．RNA的样品准备原则和数据要求 49 2，43运用SNPMAPPER在多基因控制性状的分离群体中的应用 ．．50 2．4．4复杂基因组物种中的BSA．RNA分析 50 2．4．5 SNPMAPPER需要改进的地方 ．50 第三章烟草中控制TMV侵染后产生无症状(symptomless)表型的基因的遗传克隆及分析52 3．1 前言 ．52 3．1．1植物对病原菌的抗病表现 52 3．1．1-1植物对病原菌的基础抗性(PTI) 53 3．1．1．2植物对病原菌效应子的抗病反应(ETI) ．．53 3．1．2植物的抗病基因及其抗病机制 54 3．1．2．1显性抗病及显性抗病基因 54 3．1．2．2隐性抗病及隐性抗病基因 ．．56 3．1．3植物抗病基因的克隆方法 57 3．1．3．1 图位克隆法 ．．58 3．1．3．2同源序列克隆法 ．．59 Ⅱ 万方数据 植物微型反向重复转座子数据库(P_MITE)的构建和烟草中TMV侵染后无症状表型控制基因的遗传克隆3．1．3_3转座子标签法 植物微型反向重复转座子数据库(P_MITE)的构建和烟草中TMV侵染后无症状表型控制基因的遗传克隆 3．1．3_3转座子标签法 。59 3．1．4烟草花叶病毒(TOBACCO MOSAIC VIRUS) 60 3．1．4．1烟草花叶病毒的结构 。60 3．1．4．2烟草花叶病毒的复制 。6l 3．1．4．3烟草花叶病毒互作的宿主因子 ．．6l 3．1．5课题的由来及研究意义 62 3．2材料与方法 ．64 3．2．1基因组及软件工具 64 3．2．1．1基因组序列 64 3．2．1．2软件工具 ．．64 3．2．2实验材料 65 3．2．3 TMV的繁殖和接种 ．．65 3．2．4植物总蛋白的提取 65 3．2．5植物体内TMV量的WESTERN BLOT检测 ．65 3．2．5．1 TMV多克隆抗体抗原设计 ．66 3．2．5．2 SDS．PAGE电泳 。66 3．2．5．3 Western Blot检测 67 3．2．6近等基因系的构建及数据分析 68 3．2．6．1近等基因系的构建 68 3．2．6．2测序样品准备 。68 3．2．6．3数据分析 。68 3．2．7生物信息学分析 68 3．2．7．1 RNA样品准备和RNA．BSA数据分析 ．68 3．2．7．2亲本基因组重测序 ．．69 3．2．7．3亲本SNP标记的鉴定 ．69 3．2．7．4 比较基因组学分析 69 3．2．8 CAPS分子标记的开发 ．69 3．2．9转化载体的构建 ．70 3．2．9．1遗传互补载体的构建 。70 3．2．9．2超表达载体的构建 ．71 3．2．9．3干涉载体的构建 。72 3．2．10遗传转化 ．72 3．2．10．1烟草的遗传转化 ．72 3．2．10．2番茄的转化 。73 3．2．1l转基因苗的阳性鉴定 。74 3．2．