ros诱发p53介导的信号通路对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标记和致谢的部分外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得任何教育机构的学位或学历而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 研究生签名：蛰隐宴： 日期： 垫f』生主目笪目 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下所完成的学位论文，学校有权保存其电子和纸制文档，可 以借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密论文，按 保密的有关规定和程序处理。 本学位论文属于： 1．保密 口，在 年后适用于本声明；2．不保密“ 研究生签名：型灶导师签名：沲日期：一 万方数据 摘要近年来，胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎干细胞工程等极大地促进畜牧 摘要 近年来，胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎干细胞工程等极大地促进畜牧 业的发展，而这些新技术的应用却受到的胚胎来源的制约。胚胎在体外发育过程 中，常常会发生阻滞现象，潜在的机制迄今还未明了。ROS是生物体内产生的 超氧阴离子(02一)、过氧化氢(H202)、羟自由基(·OH)等活性含氧化合物的总称。 课题组前期研究表明，胚胎在体外培养过程中，会产生ROS导致胚胎氧化应激 现象，但其详细的作用机理还不明确。肿瘤抑制蛋白P53作为一种细胞周期和细 胞凋亡的调控者，与氧化应激反应具有密切关联，但其在胚胎中所起的作用知之 甚少。所以我们假设P53在胚胎体外发育过程中在发生氧化应激时扮演重要作 用，围绕ROS与P53之间的信号通路的调控作用，深入探讨ROS引起小鼠胚胎 体外发育阻滞现象的机制。为此，本研究做了以下方面的实验： 实验一、过氧化氢诱导的胚胎氧化应激反应 首先探讨不同浓度的过氧化氢以及不同浓度抗氧化剂N．乙酰半胱氨酸 eqAC)对胚胎发育的影响，筛选出本实验最佳的胚胎氧化应激模型为后续实验做 准备。结果表明，随着过氧化氢浓度的增加(25州、50 gM、100“M)，胚胎4 细胞发育率、囊胚率显著性降低(pD．05)，从中优选出50 p．M／L的过氧化氢为 最佳应激浓度，且在添加不同浓度(1mM、5mM、25mM)的NAC实验中，5rmM 时4细胞率、囊胚率显著高于其他组(p0．05)，确定了5mM为最佳抗氧化浓度。 观察胚胎内部ROS水平发现，过氧化氢能显著性增加胚胎内部ROS水平，添加 NAC能显著降低胚胎中ROS水平。同时，本实验结合PI染色，发现过氧化氢 刺激的胚胎PI染色相对其他组较高。为进一步评估氧化损伤程度，对脂质过氧 化产物MDA测定发现，过氧化氢刺激的胚胎MDA含量显著性升高。因此，证 明了一定浓度的H202能够引起胚胎氧化应激，导致ROS升高、MDA表达增加 的胚胎发育阻滞现象。 实验二、ROS诱导P53信号通路对胚胎发育的影响 实验主要探讨应激后的胚胎ROS是如何调控P53及其相关信号通路的变化 引起阻滞现象发生。实验结果表明，过氧化氢能够导致、P53基因表达上调，细胞 周期相关基因cdc2、CDK4、CDK6下调，尤其是cdc2基因显著性的降4k王(pO．05)， 而且在蛋白水平上也发现H202月 v．够引起P53．serl5磷酸化蛋白表达升高以及相应 的P53蛋白高表达；为了进一步探讨ROS引起的相关基因变化是由P53介导发 万方数据 生，通过抑制剂PFT-a干扰P53表达，结果发现，在P53基因、P53．serl5磷酸 生，通过抑制剂PFT-a干扰P53表达，结果发现，在P53基因、P53．serl5磷酸 化蛋白和P53蛋白表达显著性抑制后，GADD45、P21基因的mRNA表达水平 显著性下调，而细胞周期基因cdc2的表达显著性高于对照组与过氧化氢组 (pD．05)，暗示出在抑制P53表达后，相关检验点基因与细胞周期基因的表达 与抑制前相比发生了明显相反改变，因此ROS引起的胚胎发育阻滞现象可能是 通过氧化应激诱导P53介导的信号通路诱发的。 实验三、P53在早期胚胎中的氧化还原作用 本章实验继续从氧化酶的角度，更深入讨论的P53对早期胚胎体外发育的调 控。实验首先观察了抑制P53的表达对胚胎内ROS水平的影响，其后测定了不 同处理下对抗氧化酶和促氧化酶的基因mRNA、蛋白表达的影响，来观察P53 对胚胎内氧化还原系统的影响。结果表明，抑制P53表达会增加ROS含量，抑 制抗氧化酶SOD、GPX等表达。在无应激胚胎中低水平P53可以增加抗氧化酶 S