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弓形虫多表位抗原ELISA的建立及规模化猪场弓形虫病的防控措施研究摘要 弓形虫多表位抗原ELISA的建立及规模化猪场弓形虫病的防控措施研究 摘要 弓形虫是一种全球范围广泛流行的人畜共患的寄生原虫，全球约有1／5的人感 染弓形虫病，孕妇感染弓形虫病可导致流产、畸胎和死胎，对免疫抑制和器官移植 病人有致命的危险。弓形虫感染猪后不仅可以导致母猪的流产、猪群的发病，被包 囊污染的猪肉也是人类感染弓形虫的主要因素。目前没有有效的疫苗预防弓形虫的 感染，所以弓形虫的防治主要依赖药物治疗，而药物的长期不规范使用导致了抗药 性弓形虫虫株的产生，抗药性的出现增加了规模化养殖弓形虫病防控的难度。由于 弓形虫复杂的生活史，用单一抗原包被的ELISA板不能检测到每个感染阶段的抗体。 本试验选择了弓形虫已报道的SAGl、GRAl、ROP2、GRA4和MIC3等多个 优势抗原，将它们的抗原表位拼接形成多表位抗原(multiepitope antigenic gene， MAO)，DNAstar分析其有很好的抗原活性。构建pGEX．KG．MAG重组表达质粒并 在E．coli BL21．CodonPlus中稳定表达，优化了最佳的表达条件，Westem-blot验证 MAG具有免疫活性。用MAG作为抗原建立MAG．ELISA方法，检测其它5种常见 猪病的阳性血清都为阴性；批间和批内重复性实验的变异系数均小于lO％；在4℃ 可以保存6个月以上；用MAG-ELISA检测797份临床猪血清，检出率比AG-ELISA 高3．0％，说明这种检测方法有较好的敏感性、特异性及较长的保质期。 收集来源于全国不同地区的弓形虫阳性样品，扩增DHPS，DHFR和C)怕基因 并测序，验证国内是否存在抗药性的弓形虫虫株。结果在20份不同的样品中并没有 发现抗药性的突变，这说明已知的抗药性虫株在国内并没有普遍流行。 从2008年6月到2009年8月对湖北和河南两省的15个规模化猪场进行弓形虫 病的流行病学调查，阳性率为24．5％。按照弓形虫抗体阳性率的不同将规模化猪场 分为三类：高度流行(阳性率30％)、中等程度流行(15％阳性率30％)和轻 度流行(阳性率15％)，并采用不同的防控方案。方案实施一年后三种猪场的弓 形虫抗体阳性率分别由33．1％降低到23．8％、23．3％降为13．0％、12．6％降为9．7％， 由此可以看出防控方案的效果比较理想。在方案实施的同时还监测了一个猪场猪瘟 抗体的变化，弓形虫抗体阳性率由36．9％降为23．1％，但猪瘟抗体的阳性率由65．9％ 升高到77．6％，这说明弓形虫的防控对猪场的免疫效果也有促进作用。 本研究建立的MAG．ELISA方法，解决了目前单一抗原检测弓形虫抗体敏感性 低的问题。对国内不同地区的弓形虫样品进行抗药性检测，结果并没有发现抗药性 虫株的流行。对规模化猪场实施弓形虫病防控方案取得较好的效果，说明此方案的 可行性。 关键词：弓形虫；MAG．ELISA；抗药性；规模化猪场；弓形虫防控方案 华中农业大学201 华中农业大学201 l届硕士研究生学位论文 Abstract Toxoplasma gondii is a protozoon infecting both human beings and animals all over the world．1／5 global population have infected toxoplasmosis．It is a lethal threat for immunodepressed and organ transplant patients，while it could result in abortion，teras and stillbirth to the gravidas．Pigs could also infect Toxoplasma gondii and show abortion or collective symptoms．The pork containing Toxoplasma gondii cysts is the major risk for human infection．There is no effective vaccine to prevent the infection．Thus the prevention and control of Toxoplasma gondii is most dependent on the drugs．However， drug resistance strains of Toxoplasma gondii were engendered due to the nonstandard use for a long