干扰素诱导蛋白viperin通过与hvap33相互作用抑制丙型肝炎病毒的复制病原生物学专业论文.docxVIP

复旦大学硕士学位论文 复旦大学硕士学位论文 中文摘要 硕士学位论文中文摘要 干扰素诱导蛋白Viperin通过与hVAP一33相 互用抑制丙型肝炎病毒的复制 硕士生：王珊珊 导师：袁正宏 丙型肝炎病毒(HCV)是一种严重危害人类健康的重要病原体，全球约有 1．7亿感染者。HCV感染极易慢性化，可进展为慢性肝炎，肝硬化和肝癌。目 前，HCV的感染主要采用以I型干扰素(IFN．Q)为主的治疗方案。干扰素代 表了机体对抗病毒感染的第一道防线，许多基因的表达受IFN的调节。目前已 知，蛋白激酶R(PKR)、2’．5’寡腺苷酸合成酶(2’．5 OAS)、载脂蛋白BmRNA 编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)等，作用于病毒生活周期的不同阶段， 抑制了病毒的入胞、脱衣壳、翻译、RNA的复制以及病毒粒子的包装、成熟、 释放。尽管如此，对于大多数干扰素诱导蛋白的抗病毒作用机制，目前仍然不是 很清楚。 Viperin(for—virus inhibitory 12rotein，endoplasmic_reticulum-associated， interferon．inducible)是一种由I型和II型干扰素诱导的，在进化上高度保守的干 扰素诱导蛋白。2005年，Karla．Helbig等人首次报道了在体外HCV亚基因组复 制子(Replicon)系统中，Viperin可以抑制HCV病毒的复制，并且发现在所有 检测的慢性HCV感染病人的肝穿标本中Viperin都呈现高水平表达，提示Viperin 可能在机体抑制HCV病毒感染中发挥重要作用。本室前期的研究在细胞水平证 实Viperin对HCV的抑制作用，在探讨Viperin抑制HCV复制的机制时发现在 HEK．293T细胞中Viperin与宿主细胞蛋白h-VAP33存在相互作用，而h-VAP33 是文献早已报道的参与HCV复制复合体组成的重要蛋白，为此拟进一步对两者 间的相互作用进行深入研究，并探讨这种相互作用对Viperin抑制HCV复制的意 义。 本研究首先在支持HCV复制的肝癌细胞系Huh7细胞中验证了Viperin与 h-VAP33的相互作用。在Huh7细胞中共转Viperin和h．VAP33，利用免疫共沉 复旦大学硕士学位论文 复旦大学硕士学位论文 中文摘要 淀和荧光共聚焦分析技术，均证实在Huh7细胞中Viperin与h-VAP33存在明显 的相互作用。 进一步对Viperin与h-VAP33相互作用的区段进行分析研究。据文献报道 Viperin由位于N末端的锌指结构域(Putative Leucine Zip)，中部具有潜在SAM 酶活性结构域(Radical SAM domain)和C端未知功能结构域(Unknown C-terminal domain)组成。而hⅥ心．33是一个含有243个氨基酸的蛋白质，包含 有N段的主要精蛋白结构域(Major sperm protein domain，MSP)，C段的卷曲 螺旋结构域(Coiled-coil domain)以及位于最C末端的跨膜域(啪)。因此分 别构建了Vipcrin与h-VAP33一系列的截短体，利用免疫共沉淀和免疫共聚焦实 验分析技术对这些截短体的相互作用情况进行研究。结果显示hVAP．33的c段 卷曲螺旋结构域(Coiled．coil domain)与Viperin的C端未知功能结构域(Unknown C．terminal domain)介导了这两个蛋白的相互作用。 由于已有研究报道hVAP．33通过N段的主要精蛋白结构域(Major sperm protein domain，MSP)和C段的卷曲螺旋结构域(Coiled．coil domain)分别与 HCV的非结构蛋白NS5B和NS5A相互作用，并将其锚定在ER膜上促进HCV 在细胞内的复制，而本研究发现Viperin也通过hVAP．33的C段的卷曲螺旋结构 域(Coiled．coil domain)与该蛋白结合，由此推测Viperin通过与NS5A竞争性 结合hVAP．33而干扰了NS5A和hVAP．33的相互作用，从而破坏HCV复制复合 体的组装而发挥其抗HCV作用。竞争实验结果显示，在Viperin存在的情况下 hVAP．33与NS5A的相互作用确实受到显著抑制，而hVAP．33与NS5B的相互作 用则没有受到影响。进一步在293T细胞中共转染HA．Viperin-e144、mye：NS5A、 flag-hVAP一33以及HA-vec