弓形虫发育期特异双荧光指示株及mic3基因敲除株的构建预防兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．3．2弓形虫SAGl、BAGl启动子和GRA2终止子编码序列的获得 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．3．2弓形虫SAGl、BAGl启动子和GRA2终止子编码序列的获得 19 2．3．2．1弓形虫SAGlp、BAGlp和GRA2 t的生物信息学分析 ．19 2．3．2．2弓形虫SAGl、BAGl启动子和GRA2终止子的PCR扩增 ．．20 2．3．3同源重组载体的构建 。20 2-3．3．1 overlap PCR扩增融合片段 20 2．3．3．2目的片段回收与纯化 2l 2．3．3．3回收片段与pEASY-Blunt载体的连接 22 2．3．3．4大肠杆菌化学感受态细胞的制备 22 2．3．3．5连接产物的转化 23 2．3．3．6质粒提取 23 2．3．3．7质粒的酶切鉴定 23 2．3．3．8重组质粒的构建 24 2．3．3．9重组质粒序列的测定与比对分析 24 2．3．3．10 HFF成纤维细胞的培养 一24 2．3．3．11去内毒素质粒的提取 ．25 2．3．3．12电穿孔法转染弓形虫RH株 ．26 2．3．3．13质粒转染虫株在细胞中的药物筛选 ．26 2．4结果与分析 。26 2．4．1弓形虫SAGlp、BAGlp和GRA2t编码基因的获得 一26 2．4．2绿荧光蛋白GFP和红荧光蛋白RFP编码基因的获得 27 2．4．3 SAGlp．GFP．GRA2t和BAGlp．I强P．GRA2t融合片段获得 ．28 2．4．4带有上述融合片段转染质粒peDNA3．1(+)获得 29 2．4．5带有DHFR药物标记的转染质粒peDNA3．1(+)获得 。30 2．4．6突变株弓形虫的筛选获得 31 2．4．7突变株荧光弓形虫的PCR鉴定 ．32 2．4．8讨论 33 2．4．8．1观察弓形虫速殖子缓殖子体外转化可行性 33 2．4．8．2弓形虫电转化技术的选择 ．33 3弓形虫M【C3缺失突变株的构建 35 3．1研究目的和意义 。35 3．2材料与方法 ．36 3．2．1实验材料 36 3．2．1．1实验动物 -36 3．2．1．2虫株、菌株和细胞 36 3．2．1．3载体与质粒 36 3．2．1．4引物 。37 3．3实验方法 。37 3．3．1弓形虫RH株速殖子的培养、收集与纯化 ．37 3．3．1．1小鼠体内弓形虫RH株速殖子传代培养 ．．37 3．3．1．2弓形虫RH株速殖子的纯化 ．．38 3．3．1．3弓形虫RH株基因组DNA的提取 38 3．3．1．4 HFF成纤维细胞的培养 ．39 3．3．1．5 C砒SPR质粒的构建 ．39 Ⅱ 万方数据 弓形虫阶段特异双荧光突变株及MIC3基因敲出株的构建3．3．1．6具有同源臂的筛选标记质粒(GOI．DmiR)的构建 弓形虫阶段特异双荧光突变株及MIC3基因敲出株的构建 3．3．1．6具有同源臂的筛选标记质粒(GOI．DmiR)的构建 ．．41 3．3．1．7去内毒素质粒的提取 42 3．3．1．8 CRISPR转染质粒和同源模板的制备 43 3．3．1．9弓形虫的转染 ．．43 3．3．1．10基因敲除弓形虫的筛选 43 3．3．1．11小鼠毒力实验 ．45 3．4结果与分析 ．．45 3．4．1 MIC3敲除质粒的构建 45 3．4．2 MIC3敲除株的PCRl，PCR2和PCR3结果 45 3．4．3 MIC3敲除株的噬斑试验 46 3．4．4 MIC3敲除株的小鼠毒力实验 47 3．4．5 MIC3敲除株的生长实验 ．47 3．4．6讨j仑 ．．48 3．4．6．1弓形虫微线体蛋白的重要性 48 3．4．6．2 CRISPR／Cas9系统的高效准确性 49 4结{念 ．51 参考文献 52 致谢 一59 III 万方数据 弓形虫阶段特异双荧光突变株及MIC3基因敲出株的构建摘要 弓形虫阶段特异双荧光突变株及MIC3基因敲出株的构建 摘要 刚地弓形虫是一种专性寄生于的有核细胞内的寄生原虫，属于顶复门球虫纲， 一旦感染会引起人兽共患弓形虫病。弓形虫以生活史复杂，感染宿主广泛闻名于世， 几乎所有温血动物包括人类在内均可作为其中间宿主，被誉为最成功的寄生原虫。 本研究构建两种弓形虫突变株，分别为从虫体的转化和入侵两方面研究提供一定帮 助。 (1)弓形虫速殖子缓殖子双荧光突变株的构建 每当弓形虫速殖子首次入侵宿主时，通常导致急性感染，若处理不当产生严重 并发症甚至死亡。而通常在免疫系统以及药物作用下，速殖子会逐渐转化为缓殖子， 缓殖子聚集形成包囊，进而转变为慢性感染。慢性感染一般不呈现任何临床症状。 而一旦宿主免疫系统减弱或抑制时，例如艾滋病和器官移植造成的免疫抑制时，缓