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华中农业大学2016届博士研究生学位论文4．2．8生物被膜实验 华中农业大学2016届博士研究生学位论文 4．2．8生物被膜实验 一54 4．2．9荧光定量PCR ．54 4．3结果与分析 。55 4．3．1 MsmK对猪链球菌致病性的影响 ～55 4．3．2 msmK缺失菌株在宿主体内的定植能力减弱 57 4．3．3 msmK缺失菌株对全血和吞噬细胞的抵抗能力减弱 57 4．3．4 msmK缺失菌株的溶血活性减弱 59 4．3．5 msmK缺失菌株的粘附能力增强 60 4．3．6 msmK缺失菌株对渗透压和过氧环境的抵抗能力减弱 61 4．3．7 msmK缺失菌株形成生物被膜的能力减弱 6l 4．4讨论 ．6：1 4．4．1碳源的利用调控猪链球菌毒力的机制 ～62 4．4．2 MsmK影响猪链球菌在组织中的定植 一62 4．4．3 MsmK影响猪链球菌在血液中的存活 。63 5 MsmK影响猪链球菌细胞分裂过程的机制研究 65 5．1前言 ．65 5．2材料和方法 一66 5．2．1菌株、质粒及引物 ．66 5．2．2细菌双杂交用试剂与培养基的配制 一67 5．2．3重组质粒的构建 ．68 5．2．4蛋白的表达与纯化 ．69 5．2．5细菌双杂交实验 69 5．2．6表面等离子共振实验 。69 5．2．7 ELISA实验 70 5．2．8 MsmK和同源物GTPase活性的测定 70 5．2．9超速离心实验 一70 5．2．10透射电镜观察FtsZ多聚体的形成 一71 5．2．11透射电镜观察细菌形态 71 5．2．12扫描电镜观察细菌形态 7l 5．2．13荧光定量PCR 一71 5．3结果与分析 72 5．3．1链球菌中FtsZ蛋白的鉴定 72 5．3．2 MsmK和FtsZ存在相互作用 ．74 5．3．3 MsmK和FtsZ相互作用的位点均在N端 75 5．3．4 MsmK同源蛋白质与猪链球菌FtsZ的互作情况 ．77 5．3．5 MsmK具有GTPase活性 78 5．3．6 MsmK在体外促进FtSz多聚体的形成 ．78 5．3．7 msmK基因缺失突变株生长情况 81 5．3．8 MsmK影响猪链球菌的形态 82 5．3．9细胞分裂相关基因转录水平的变化 ．83 5．4讨论 ．8zI 5．4．1 FtsZ的调控 84 5．4．2 MsmK具有GTP酶活性 86 5．4．3 MsmK促进Ftsz的多聚化 ．87 5．4．4 MsmK影响细菌形态 一88 5．4．5 MsmK影响细胞分裂相关基因的表达量 一89 结论与展望 91 参考文献 92 论文发表 一l 05 毁谢 106 II 万方数据 MsmK调控猪链球菌生长和致病性的研究摘要 MsmK调控猪链球菌生长和致病性的研究 摘要 猪链球菌(Streptococcus suis)是具有荚膜的革兰氏阳性球菌，通常定植于猪的 上呼吸道，主要是鼻腔和扁桃体。根据荚膜抗原成分，可将猪链球菌分成33个血清 型，其中2型猪链球菌(SS2)被认为是毒力最强的血清型，是临床上分离的主要血 清型。猪链球菌可引起感染猪的败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎等症状，给养 猪业造成了巨大的经济损失。同时，猪链球菌引起人的脑炎和中毒样休克综合症， 严重时导致死亡，威胁着人类的健康。对于病原菌来说，在宿主体内获取营养物质 是其生存和繁殖进而损伤动物机体的前提。碳源的利用与病原菌的生存和致病性息 息相关。碳源的获取和利用影响SS2在宿主口咽腔的定植平衡态，调控毒力因子的 表达，促进致病进程。一些碳源代谢相关的蛋白质也是SS2的毒力因子。本研究对 ATP酶MsmK在SS2的碳源转运、致病性以及细胞分裂三个方面的功能进行了研究， 主要研究结果如下： l、猪链球菌MsmK是多种碳水化合物ABC转运子的ATP酶 所有异养型细菌必须从外界摄取营养物质，以保证其生命活动和生长繁殖。a- 葡聚糖的利用对于维持SS2在感染的各个阶段的生存、繁殖和毒力尤为重要。细菌 转运碳水化合物的方式有两种：磷酸转移酶系统(PTS)和ABC转运子。关于旺一 葡聚糖降解产物的转运在猪链球菌中还缺乏研究。本实验以SS2菌株SC—19为研究 对象，分析比较了两对ABC转运子msmEFG和malXCD基因簇在SC．19基因组中 的位置，实验证明了MsmEFG负责转运棉籽糖和蜜二糖，而MalXCD负责a一葡聚 糖降解产物的转运。在SC．19中，SSUSC84—1724编码蛋白质MsmK具有ATP酶活 性。将MsmK缺失突变株用含不同碳源的人工培养基培养，发现突变株不能再利用 棉籽糖、蜜二糖以及麦芽糊精。此外，MsmK在这些碳源中的表达水平明显升高， 说明MsmK属于MsmEFG和MaIXCD转运子的组分，其生理功能是为这两个转运 子水