酵母双杂交系统筛选dnd1相互作用蛋白生理学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘 摘 要 目的：应用酵母双杂交系统筛选小鼠胚胎cDNA文库中与DNDl 相互作用的蛋白，进一步明确Dndl的生物学功能，为探明Dndl的 信号传导通路及阐明Dndl基因在TGCT发生中的分子机制奠定基 础。 方法：@PCR法从胚胎cDNA文库扩增小鼠Dndl基因编码区序 列，构建重组质粒pMDl8．T-Dndl，再将Dndl基因片段亚克隆至诱 饵载体pDBLeu并对重组诱饵质粒pDBLeu．Dndl进行酶切及测序鉴 定。②将诱饵质粒转化酵母宿主菌，卢．半乳糖苷酶滤纸法检测其对 报告基因LacZ的激活作用；观察转化后酵母菌的生长状态及增殖速 度，分析其对宿主菌的毒性作用。③确定合适的3AT浓度，而后将 文库质粒pPC86．Library转化含诱饵质粒的酵母菌并涂布于营养缺陷 培养基进行三轮筛选并用卢．半乳糖苷酶滤纸法分析其LacZ表型。④ 提取阳性克隆酵母质粒，电转化E．coli DHl0B，利用Amp‘LB平板筛 选文库质粒转化子，提取质粒，PCR确定文库质粒片段大小，并检测 文库质粒AD．Library自身激活作用，最后文库质粒转化含诱饵质粒 的酵母菌验证蛋白相互作用。对最终确定的阳性克隆文库质粒测序并 对测序结果进行初步分析。 结果：①酶切和测序分析表明Dndl基因序列及读码框均正确。 ②诱饵质粒pDBLeu．Dndl成功转化酵母菌MaV203，经检测其无自 身激活作用且对酵母菌无毒性。③确定了最适3AT浓度为30mM，转 化文库后经三轮筛选，分别得到172，10和8个阳性克隆。④生物信 息学分析显示，8个阳性克隆文库质粒分别编码4种蛋白，分别为Jun 蛋白、辅肌动蛋白口1、核受体结合蛋白1和氯离子通道2，并且均有 重要的生物学功能。 结论：①成功构建诱饵质粒pDBLeu．Dndl。②诱饵质粒 pDBLeu．Dndl没有自身激活作用和毒性作用，可用于该酵母双杂交 系统进行文库筛选。③ 系统进行文库筛选。③筛选小鼠胚胎cDNA文库得到4个与DNDl 相互作用的蛋白，分别为Jun蛋白、辅肌动蛋白口1、核受体结合蛋 白1和氯离子通道2。 关键词：酵母双杂交系统，DNDl，睾丸生殖细胞瘤，蛋白相互作用 n ABSTRACTObjective ABSTRACT Objective：To have an insight into the function of Dndl and lay a foundation for investigating the signal pathway as well as the role of Dndl gene in the development of testicular germ cell tumors，yeast two-hybrid system was used to screen proteins interacting with DND 1． Methods：@The eDNA fragment of Dnd l，which was amplified from mouse embryo cDNA library by PCR，was inserted into the bait vector pDBLeu．Identifying the recombinant plasmid by restriction endonuclease analysis and PCR assay．@The recombinant plasmid pDBLeu-Dndl was transformed into yeast strain MaV203．The BD—Bait protein was examined for the reporter gene LacZ activation by 芦一galactosidase filter assay and toxicity to the yeast strain through examining the proliferation speed．③The AD．Library plasmid was transformed into yeasts containing the bait plasmid．The yeasts containing the bait and prey plasmid were plated on synthetic dropout nutrient medium．The screen of positive clones was performed for three times via analyzing the type of LacZ by B·galactosidase