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第二节 体外受精 In vitro fertilization，IVF 一、概念、意义及发展历史 二、IVF的基本程序 三、IVF的应用前景 第二节 体外受精 In vitro fertilization 一、概念、意义及发展历史 1、概念： 在自然条件下，哺乳动物精子和卵子的受精过程是在体内完成的。如将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程，称为体外受精(in vitro fertilization，IVF)。 由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等。 2、发展历史 早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术，但一直没有获得成功。直到1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。 1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。 2、发展历史（续） 体外受精技术的发展简史 3、意义 （1）研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。 （2）在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。 （3）在人类，IVF技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。 （4）体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。  二、体外受精的基本操作程序： 卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation, IVM） 卵子和精子的体外受精（ in vitro fertilization, IVF） 受精卵的体外培养（ in vitro culture, IVC） 二、体外受精的基本程序 （一）卵母细胞的采集和成熟培养 1、离体卵巢采卵：是从屠宰母畜的卵巢采集卵母细胞（主要来源） （1）卵泡抽吸法 （2）卵巢解剖法 2、活体采卵：是从活母畜的卵巢采集卵母细胞（优良品种） B超引导法：借助超声波(B超)探头和屏幕的引导，从活母畜卵巢采集卵母细胞。操作员先将带有B超探头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上。根据B超屏幕所显示的卵泡位置，利用采卵针穿刺卵泡并同时抽吸卵母细胞。 3、卵母细胞的体外成熟（IVC） 1）、培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199。培养时尚要加入一定的血清和激素。 2）、温度和气相：牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体外成熟培养的温度一般为38～39℃。所有哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含5％C02的空气和最大湿度的环境。 3）．培养时间： 牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为22～24h，而马为30～36h，猪为40～44h。 4）．培养方法：卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用微滴法、封闭法和开放法三种。 （二）卵母细胞的体外受精（IVF） 1、精子的制备：悬浮法（swim up）；直接离心法；哌可（Percoll）密度梯度离心法 2、精子获能处理：肝素处理法；钙离子载体法；高渗溶液处理法 3、受精液：通常使用Tyrode’s改良液和BO液 4、受精方法：微滴法、四孔培养板法 5、精卵共培养的时间、温度和气相：受精后，卵母细胞应立即放入温度39℃，含5％CO2的空气和最大相对湿度的CO2培养箱中培养24～44h，其中牛22～24h，将假定的受精卵从受精液中取出，再在早期胚胎体外培养液中继续培养18～33h。受精后40～44h检查受精卵的分裂率 * * 20世纪80年代中期以后，以牛为代表的家畜IVF技术发展迅速，1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。这对牛IVF的研究和应用具有重要意义，因为这种方法可利用屠宰场废弃的卵巢和冷冻精液进行胚胎体外生产，不仅成本低廉，而且效果稳定。此后，牛的卵母细胞体外成熟和胚胎培养体系逐步趋于成熟，胚胎体外生产效率得到很大提高。目前，采用IVF-ET技术，每对废弃的牛卵巢可获得3头左右的犊牛。为充分利用良种母牛的遗传资源，20世纪80年代后期，牛的活体取卵技术（Ovum pick UP.OPU）发展迅速。活体取卵和IVF-ET结合已成为欧、美和大洋洲等畜牧业发