蝉蜕多糖分离纯化.docVIP

. 页 蝉蜕多糖的分离纯化 实验目的：掌握多糖的分离纯化方法。 实验原理：根据相似相容的特点，糖类易溶于水，不容于有机溶剂，可用水提醇沉的方法进行提取。采用醇沉法获得的多糖常混有较多的蛋白质，可用盐酸法除去蛋白质。 实验材料 蝉蜕 95％乙醇 盐酸 蒸馏水 电热鼓风干燥箱 粉碎机 冰箱 离心机 圆底烧瓶 试管 实验步骤 预处理 ?拣选蝉蜕清洗除杂3～4次，反复漂洗，直至水澄清。 ?将样品放在报纸上摊开，置于60℃鼓风干燥箱中恒温鼓风加热干燥8h，称重。 ?高速粉碎机粉碎，粉碎后样品过筛备用。 提取（水提醇沉） ?称取蝉蜕药材细粉8g于250mL圆底烧瓶。 ?按固液比1∶20加蒸馏水，回流提取3次，每次1h。 ?合并提取液，浓缩至药液比1∶1，加入95%乙醇至含醇量90%。 ?置冰箱中放置过夜后4500r/min离心15min。 ?取上清液回收干燥，即得蝉蜕90%水提醇沉物残渣干燥，即得醇沉渣。 纯化 取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH 至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀即脱去蛋白质。 实验观察 预处理后用碱溶液提取法提取蝉蜕多糖。具体方法：将处理后的蝉蜕加入2倍体积的1mol/LNaOH,在100℃水浴中加热1h，过滤收集滤液，在滤渣中加入2倍体积的1mol/LNaOH,在100℃水浴中加热1.5h，过滤收集滤液,重复此操作3次，每次重复分别增加0.5h，最后合并滤液。100℃水浴浓缩至原体积0.2倍，加入3倍体积的冰冻无水乙醇，4℃过夜，6000r/min离心10min弃上清液，沉淀用蒸馏水溶解，沸水浴浓缩，无水乙醇沉淀，离心除去有机溶剂,收集沉淀，50℃干燥至恒重即为蝉蜕多糖。共进行3批次平行实验。 1、?制作标准曲线： ?准确称取105?℃烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1?mg/ml?的标准溶液，用蒸馏水分别配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1?mg/ml。 ?1?ml标准液分别加入?5%?苯酚溶液1?ml，并迅速加入浓硫酸5?ml，静置10?min。 ?摇匀，30℃放置30?min后于490nm测定OD值。 ?以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。? 2\?样品含量测定：吸取1.0ml样品液，按照上述步骤操作测定OD490，并代入标准曲线计算样品的总糖含量。 蝉蜕多糖的分离纯化 摘 要 ：目的 ： 本实验是从蝉衣中提取多糖, 并研究蝉蜕多糖的性质。方法 ：将蝉衣去除杂质，使用膜超滤对多糖进行分离提取，进行脱 钙、 脱蛋 白、 脱 乙酰等 处理； 采用酸碱滴定法测定脱乙酰度 ,超离心法测定提取多糖的纯度,凝胶色谱法粗略测定多糖的相对分子质量,硫酸蒽酮法测定多糖的总含量。结果:蝉衣多糖的平均提取率为---，脱乙酰度为---，蝉衣多糖的纯度,-- 相对分子质量为---,多糖的总含量为---结论 ：蝉衣多糖易提取,且纯度较高,具有研究价值。 关键词:蝉蜕;多糖;提取 蝉蜕(Periostracumcicadae，PC)为蝉科昆虫黑蚱Cryptotympana pustulata Fabricius的若虫羽化时的蜕壳［1］，别名蝉衣蝉蜕蝉壳知了壳［2］首载于名医别录，蝉蜕性甘寒，味咸，是一种常用中药，具有散风解热清肺利咽解表透疹解毒消炎清肝明目，安神定志止咳平喘息风止痉明目退翳之功效［3，4］，现代药理学研究表明，蝉蜕除具有解热镇痛镇静抗惊厥解痉等作用外，还具有一定的抗凝作用，如蝉蜕水提液可显著降低高脂血症大鼠红细胞聚集指数，抵抗体外血栓形成，并能明显缓解哮喘的微观血瘀状态［5］。 随着科学技术的发展，其功效不断地被发现，且效果明显，现代药效学证实,本实验对蝉蜕的多糖进行提取分离，为研究蝉蜕的有效成分提供基础数据。 1试剂与仪器 2方法 2.1预处理［6］ 拣选蝉蜕清洗除杂3～4次，反复漂洗，直至水澄清。将样品放在报纸上摊开，置于60℃鼓风干燥箱中恒温鼓风加热干燥8h，称重。高速粉碎机粉碎，粉碎后样品过筛备用。 2.2多糖的分离提取 预处理后采用微波浸提［7］的方法提取蝉蜕多糖。具体方法：将处理后的蝉蜕加入10倍体积的蒸馏水，，微波功率700W、微波处理时间6min，然后4000r/min离心处理10min，收集上清液，用旋转蒸发器减压浓缩至原体积的10%。将浓缩液加入其3倍体积的体积分数为95%的乙醇，静置6h以上，4000r/min离心10min，收集沉淀，冷冻干燥得粗多糖。取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH 至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀即脱去蛋白质。 氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。 依次用丙酮、无水乙