拟南芥感应盐不敏感突变体筛选与初步分析.pdfVIP

摘要 土壤盐害影响了世界上约四分之三的土地，直接导致了农作物减产，影响民 生。盐害产生两种胁迫，渗透胁迫和离子胁迫。钙信号作为第二信使，在响应植 物应对盐胁迫的途径中起到了至关重要的作用。它能够调节下游基因的表达来应 对胁迫。 本实验利用水母荧光蛋白与钙离子结合后会产生荧光的现象，通过Aequorin 蛋白在拟南芥中稳定表达的株系AQ 作为材料，构建T-DNA 插入的突变体库，用 氯化钠这一最具代表性的盐作为胁迫条件，筛选对于盐胁迫不敏感，在胁迫条件 下不能导致细胞内钙离子浓度升高的拟南芥突变体。得到以下结果： （1）利用已构建好的199 个T-DNA 插入突变体库，每个库选取500~600 粒 种子进行无菌培养。在幼苗长出两片真叶的时候进行盐处理，并利用Aequorin 荧 光成像技术拍照记录拟南芥幼苗在盐胁迫处理下的荧光成像情况，挑选出不能发 出荧光或者荧光较弱的候选突变体。每个突变体库挑选约40 株幼苗进行培养，得 到F2 代种子。总共筛选出约8000 个候选突变体。 （2 ）取8000 个候选突变体F2 代种子20~30 粒，点成线状放在无菌培养基中， 培养至幼苗长出两片真叶。利用荧光成像技术对突变体进行验证。最终从8000 个 候选突变体中，得到16 个适合的突变体。 （3 ）用这16 个候选突变体的F3 代种子选取4~5 粒，培养F3 代，单株收种， 进行平行实验。利用荧光成像技术，确定该突变体的性状的稳定性。选取稳定株 系进行下一步实验。 （4 ）选取其中的sim2 （salt-stress insensitive mutant 2 ）突变体进行初步分析。 利用Adapter Ligation 技术克隆到sim2 基因，通过半定量的方法确定了sim2 基因 在突变体内不表达。利用该基因构建超表达载体；构建GFP 载体进行亚细胞定位； 用sim2 基因的启动子构建Promoter 接GUS 载体来研究基因的组织特异性表达； 构建Promoter 接 sim2 基因全长载体，以进行互补实验。并利用拟南芥花浸法转 基因，已得到F3 代拟南芥转基因种子。 （5 ）将sim2 突变体与对照（AQ ）及购买的同基因不同位点突变株系（order ） 进行生理实验比较分析。发现在盐胁迫下，sim2 突变体生长状况与对照类似；在 干旱胁迫下sim2 突变体生长状况弱于AQ 。说明sim2 突变体对于盐胁迫引发的渗 II 万方数据 透胁迫不敏感，不能使细胞内的钙浓度上升，无法引起下游的钙信号转导及调控 下游基因表达。使植物无法应对盐胁迫而生长势减弱。 （6 ）将三个株系放于含H O 培养基中进行实验。三个株系生长状况类似， 2 2 但sim2 突变体表现出抗H O 的表型，衰老速度缓于其他两个株系。 2 2 （7 ）sim2 基因在根、叶片、花丝、花萼中都表达较高，而在果荚、花瓣、 花药和茎中却较低。 经过本实验研究，我们在拟南芥抵抗盐胁迫，导致的钙离子信号转导上有了 初步的探究。 关键词：盐胁迫，水母荧光蛋白，钙离子信号转导 III 万方数据 Abstract