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实验现象: 在8mol/L尿素存在下,用巯基乙醇处理天然RNase,其二硫键全部断裂,肽链松散,活性全部丧失,但当用透析法除去尿素、巯基乙醇后,RNase活力全部恢复,而且复原后产物其物化性质与天然RNase完全相同;然而在随机情况下,8个HS—形成4个—S—S时,应有105种不同方式,但在复原过程中,走向随机的RNase肽链却只选择了其中一种方式(即与天然构象完全相同). 一、酶分子的组成 ◆ 1926年Sumner首次提出酶的蛋白质本质◆ 30年代,Northrops得到了胃蛋白酶、胰蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶的结晶,并从动力学 性质证明了它们是蛋白质◆ 酶是高分子胶体物质、两性电解质,在电场 中如蛋白质一样泳动;◆ 导致蛋白质变性的因素如温度、pH、紫外线、 表面活性剂、重金属等往往也能使酶变性;◆ 酶能被蛋白酶水解而失活; 1969年,Gutte Merrifield由氨基酸人工合成了具有催化活性的Rnase,进一步证实了酶的蛋白质本质。 蛋白质(protein,简写pro) 是由20种L-α- 氨基酸按一定的序列通过酰胺键(肽键)缩合而成的,具较稳定构象并具一定生物功能的生物大分子。 纤维状蛋白分子: 种类:角蛋白、胶原蛋白、血纤维蛋白、肌纤维蛋白。 功能:在生物体内保护、支持、结缔功能。 球蛋白分子: 种类:血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白、球蛋白、酶蛋白、激素蛋白、抗体等。 具有酶活性的蛋白质都是球蛋白 (二)、酶的活性部位 问题:酶是生物大分子物质,分子量都在10000以上,每个酶分子至少由100个以上氨基酸连接而成,而酶的作用底物多为有机小分子。可以想象,只有少数一些氨基酸残基和催化活力有关。后来证实这些特异的氨基酸残基组成了酶的活性中心。 经分析证明, DFP与胰凝乳蛋白酶的Ser-195 的羟基反应。Ser-195在酶分子中处于特殊位置,具有非常高的活性,在催化反应中起着关键作用。 (2)、从酶与底物的作用推测 令胰凝乳蛋白酶作用于对硝基苯酚乙酸酯: O CH3 C Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu 中间物用同位素标记,然后水解,得含标记的乙酰基肽段,其序列与DFP抑制剂的Ser残基周围的氨基酸序列一致。所以可以推测,DFP抑制的部位是酶催化的中“关键”部位。 2、活性部位的研究方法 化学修饰法 动力学分析法 光谱法 X线晶体衍射法 化学修饰法 酶分子中可修饰基团:羟基、 -HS基、氨基、 羧基、咪锉基等,可用于化学修饰的基团也不 少。 (1)、使用非特异试剂对特殊基团的标记; 非特异性试剂:不能区分活性部位内和活性部 位外基团的试剂。 特殊基团:某些酶的活性部位含有活性部位以 外没有的氨基酸残基,如(-HS基)。 例如:木瓜蛋白酶中有7个半胱氨酸残基,其中的6个形成三对二硫桥,只有一个残基以自由巯基形式存在于活性部位,这时就可以用任何一种巯基试剂来标记(如碘乙酸)得到巯基修饰与活力丧失相平行的结果。 若是非特殊基团,要充分利用活性部位中某一基团具有特别高的反应性的有利条件进行化学修饰。(如胰凝乳蛋白酶的Ser-195与DFP的作用) (2)、差示标记 是非特异性试剂标记的一个发展,要求被标记的活性部位基团有特殊灵敏的反应性。 + P (3)、亲和标记 主要利用酶和底物特异结合的性质 设计标记试剂。 2、动力学分析法 酶蛋白是带有许多解离基团的两性蛋白质,pH 改变必然影响解离基团的解离状态,处于活性部位的解离基团的解离状态的改变会直接关系到酶的催化活性。 例如:通过pH-酶催化活力关系的研究,可能得到 与催化直接相关的某些基团的pK值; 通过在不同温度条件下测定V与pH的关系,可求得有关基团的解离热?H,?H的测定有助于补充pK值对活性部位性质的判断。进而推断此基团的本质。 3、光谱法 依据是酶蛋白分子中含有生色基团,也可以用化学方法引入生色基团。 3、酶活性中心的概念 酶与其他蛋白质的不同之处在于,酶分子在一级结构基础上通过
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