肠致病性大肠杆菌基因芯片检测方法的研究微生物学专业论文.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 传统的抗原抗体反应来检测肠致病性大肠杆菌《EPEC)是一种很重要的微 生物检测方法，可用于流行病学调查。但是，用抗血清分型的过程过于复杂， 因此仅限于少数参考实验室使用。 为了改善这种状况，我们发明了一种基于生物芯片技术的基因水平上的检 测方法。用于检测O．抗原血清型的靶基因为编码O．抗原聚合酶的基因(wzy)， 用于检测H．抗原血清型的靶基因为编码鞭毛蛋白亚单位的基因(filc)。 从生物信息学分析和探针设计做起，我们研发了一种用于检测肠致病性大 肠杆菌血清型的基因芯片：首先用一种快速、有效的方法提取DNA，再用多重 PCR方法扩增靶基因，扩增同时进行Cy3标记，最后分析杂交结果。该芯片包 含用于检测16种不同的()．抗原血清型(018，020，026，044，055，086，0111， 01 12ac，01 14，01 19，0125．0126，0127，0128，0142，0158)的探针和15种不同的H． 抗原血清型(H2，H6，H7，H8，H9，H1 1，H16，H18，H19，H21，H25，H28，H34，H40， H49)的探针。 用检测范围内血清型的菌种和近缘菌株对该芯片进行性能评价，结果证实 它有很高的灵敏性和特异性，16种O血清型和15种H血清型均能被准确检测 出。该基因芯片检测技术被证实为传统血清分型的良好替代方法，并可以在一 天内得到样品检测结果。 关键词：肠致病性大肠杆菌，寡核苷酸芯片，O．抗原，H．抗原 Abstract—————————————————————————^——————一一———————————————————————————-—●—————————————————————————————————一 Abstract —————————————————————————^——————一一———————————————————————————-—●—————————————————————————————————一 Abstract Classical antibody—based serotyping of Enteropathogenic E coli(EPEC)is an important method in diagnostic microbiology for epiderniological purposes．However， serotyping is SO tedious that its 1use i s restricted to a few refe：rence laboratories． To improve this situation we developed and validated a genetic approach for serotyping based on the microarray technology．The genes encoding the O。antigen polymerase(wzyl were selected as target sequences for the O antigen，whereas fliC， which code for the flagellar monomer，were chosen as representatives for the H phenotype． Starting with a detail ed bioinformatic analysis and oligonucleotide design，a DNAmicroarray for detection of EPEC serotypes was}developed：a fast and robust DNA extraction method was coupled with a multiplex labeling procedure and hybridization analysis of the Cy3 labeled amplicons．The microarray contained oligonucleotide DNA probes。which represent 1 6 different O antigens(01 8，020， 026，044，055，086，0111，0112ac，0114，0119，0125，0126，0127，0128，0142， 0158)as well as 15 different H antigens(H2，H6，H7，H8，H9，H1 1，H16，H18，H19， H2 1，H25，H28，H34，H40：，H49)． Evaluation of the