他克莫司生物合成的途径特异性调控机制研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

英文论文题目：．The 英文论文题目：．The study of the pathway-specific． regUIatorV■■■■_N mecbaUis：m in tlle tacrolimUS D10SVntnenC ll■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■一 ⑧ 月^吐llo￡： 苎i垒Q墨塾星堕g圣塾垒塾2 Supervisor： 旦坠i』i垒坠g，△曼璺Q￡i垒!皇￡!竺!垒墨苎Q￡ External Reviewers： f姓名∑驱盐∑望焦。王国1 Examining Committee Chairperson： Examining Committee Members： Date of oraI defence： 万方数据 浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘茔或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 、县、签字日期： 洳／6年弓月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 逝逛太坐有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权澎逛太生 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者虢弛即 导师签名：立之捍 签字日期：阳辟多月哆日 签字日期：2al 6年了月Z岁日 万方数据 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 他克莫司(FK506)是链霉菌生产的一种23元大环内酯类免疫抑制剂，在 临床上用于治疗肝脏、肾脏、胰腺和心脏等器官移植后排斥反应。我们以他克莫 司工业生产菌株——筑波链霉菌L19为研究对象，其生物合成基因簇中包含两 个调控基因PaN和tcs7。 首先，我们利用逆转录PCR对他克莫司合成基因簇进行转录单元分析，确 定了其中含有8个转录单元：tcsA—tcsB-tcsC-tcsD；tcsl；tcs2．tcs3一tcs4一tcs5；JkbG； ．)晒B-flcbC-]kbL-jkbr-]kbJ-JkbI-fibH；flcbO-fl晒P-flcbA-jkbD—fkbM；tcs6-flcbQ-flkbN； tcs7。在筑波链霉菌L19中过表达．删和tcs7将他克莫司的产量分别提高了76％ 和40％，表明FkbN和Tcs7均是他克莫司合成基因簇内的正调控因子。 荧光定量PCR比较野生株L19和／kbN过表达菌株L21的转录水平发现，包 括调控基因tcs7在内的目的基因转录水平都得到显著增强。FkbN属于LAL家族， 比对显示FkbN可能具有ATPase活性并受到ATP的调节。异源表达纯化 FkbN—DBD进行EMSA反应，发现FkbN．DBD结合在四个启动子区：tcsAp,jkbGp、 j硒S-／kbO间隔区、tcs6-tcs7间隔区。DNase I footprinting确认了与FkbN-DBD结 合的启动子序列具有特异性，为lObp左右的反向互补保守序列。这四个启动子 区控制着他克莫司生物合成中PKS／NI心S基因、特殊前体合成基因、调控基因 tcs7等的转录，表明FkbN通过激活这些基因的转录提高了他克莫司的产量。 另一个调控因子Tcs7是LysR家族调控蛋白，我们生物信息学比对分析了包 括Tcs7在内的10种LysR蛋白，发现这些蛋白具有35．3％序列相似性，结合LysR 家族蛋白的结构与功能之间的关系，我们推测Zcs7可能具有自调控功能。荧光 定量PCR比较野生株L19和tcs7过表达菌株L22的转录水平，发现包括．肛拼 在内的目的基因表达量均有上调。将Tcs7的DNA结合结构域进行异源表达纯化， EMSA实验结果显示Tcs7．DBD只能结合在tcs6-tcs7间隔区，该间隔区存在两个 启动子分别控制tcs7和tcs6-flcbQ-jkbN的转录，表明Tes7可能直接正调控肋Ⅳ 从而提高他克莫司产量。 基于以上结果，我们对他克莫司的途径特异性调控通路进