转基因动物模型在生物医学研究中的应用.ppt

转基因动物模型在生物医学研究中的应用 现代生命科学研究的发展趋势： 转基因动物模型优势： 主要内容 一. 转基因动物模型的概念 二. 转基因动物模型的制备方法和原理 (一). 利用DNA显微注射制备转基因动物 受精卵显微注射制备转基因动物的缺点 (二).利用基因打靶技术制备转基因动物 1. ES细胞技术 ES细胞的分离培养 ES细胞技术发展历史 ES细胞技术发展历史 2. DNA同源重组技术 (homologous recombination) DNA同源重组技术 3.基因敲除或剔除（knockout） 4. 基因敲入（knockin） 5. 条件(conditional)基因打靶 Cre-LoxP技术 组织特异性的Cre转基因小鼠举例 可诱导表达的Cre转基因小鼠举例 6. 基因捕获技术（Gene Trapping） 7. 转座子介导的基因打靶 (三).利用核移植技术制备转基因动物 核移植技术 三. 转基因动物模型在医学研究中的应用 (一).研制动物模型、研究疾病机理 胰岛素受体在不同组织中特异敲除后的表型 (二).研制动物生物反应器 (三).在基因功能研究中的应用 转录因子DPZF基因敲除小鼠模型的建立 主要表型： 生长发育障碍、耳聋、低血糖、造血紊乱等 原理：建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，筛选基因的显性突变或隐性突变； 乙烷亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）：化学致突变剂，通过乙烷化反应导致DNA的随机、单碱基突变； 2000年，建立ENU基因捕获方法，进行基因显性突变的大规模筛选。 主要应用于大动物； 一般采用胎儿成纤维细胞，经基因打靶的方式将外源基因定点敲入动物基因组，再经核移植将打靶成功的成纤维细胞的核移植入去核的卵母细胞，发育成个体； 优点：将转基因动物的筛选提前到成纤维细胞的筛选，大大降低了转基因大动物制备的工作量和成本。 1938年，Spemann提出了细胞核的全能性和将分化的细胞核移植到卵母细胞的设想； 1952年，Briggs和King将蛙胚胎细胞核注射导卵内，构建的重组胚胎发育成蝌蚪和蛙； 1962年，Gurdon证实已分化的细胞核可恢复其全能性； 1969年，开始哺乳动物的核移植研究； 该技术源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射 1981年，Illmenser和Hoppe将小鼠胚胎内细胞团的细胞核植入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠； 1986年，Willadsen等用未分化的胚胎细胞克隆出一只核移植绵羊； 1987年，Robl用胚胎细胞克隆出核移植羊； 1997年，Wilmut用成年绵羊的乳腺上皮细胞为核供体，克隆出绵羊Dolly 心血管系统疾病模型：如血管紧张素与高血压、ApoE与动脉粥样硬化等； 肿瘤模型：p53、Nf1、Brac1、Rb1、Wt1等基因敲除小鼠； 神经系统疾病模型： b淀粉样前体蛋白与早老性痴呆等； 骨骼、关节疾病模型：原胶原蛋白、FGFR、碱性磷酸酶等； 代谢性疾病：糖尿病等 食欲增加、脂肪含量和瘦素水平增加、胰岛素抵抗、下丘脑促性腺功能不足 脑 葡萄糖刺激的胰岛素分泌丧失、糖耐量受损、b细胞生长受抑 胰岛b细胞 糖耐量受损、高胰岛素血症、胰岛素清除能力下降、肝功能受损 肝脏 糖耐量正常、脂肪组织增加、血TG和游离脂肪酸含量升高 骨骼肌 基因敲除小鼠的表型 基因敲除的组织 如乳腺生物反应器：将靶基因置于乳蛋白基因的控制之下，在乳汁中富集靶基因产物，如转基因牛、羊的成功建立。在生物医药产业方面具有广阔的应用前景。 趋势是利用基因打靶和核移植技术生产转基因大动物，研制生物反应器。 在后基因组时代，可以从整体水平、组织水平、细胞水平和分子水平各个层次系统研究基因的功能。是后基因组时代进行功能基因组研究的重要技术平台。 小鼠成为最重要的模式生物。 基因打靶的时空控制。 基因敲除小鼠资源的全球共享。 * 基础部病理生理学教研室 章卫平 Mario R. Capecchi, born 1937 in Italy, US citizen, PhD in Biophysics 1967, Harvard University, Cambridge, MA, USA. Howard Hughes Medical Institute Investigator and Distinguished Professor of Human Genetics and Biology at the University of Utah, Salt Lake City, UT, USA. Sir Martin J. Evans, born 1941 in Great Britain, British citizen, PhD in Anatomy an