刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布传染病预防与控制专业论文.docxVIP

0IIIIIII 0IIIIIII 11 U IIllllIlrlll IIIIIl： Y3 1 1 6464 硕士学位论文 刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体 蛋白1 6的分泌与分布 硕士研究生：姜诗晨 指导教师：彭鸿娟教授 摘要 一、研究背景 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界性分布的专性寄生于有核 细胞内的原虫，全球有三分之一以上的人口受其感染。人体可因食入含包囊的 未熟的肉制品和被卵囊污染的食物或水而感染弓形虫。作为一种机会致病性原 虫，正常人感染弓形虫通常呈无症状带虫状态，然而，当弓形虫感染免疫功能 缺陷者，如接受免疫抑制治疗者、恶性肿瘤放疗和艾滋病患者时，可在患者体 内迅速增殖并广泛散播，主要侵犯人脑、眼和淋巴结等，表现为多器官损害， 甚至引起死亡。孕妇在首次感染弓形虫后可经胎盘垂直传播给JJ台JL，导致流产、 早产、畸胎，死胎和新生儿眼弓形虫病等。弓形虫还可寄生于牲畜和鸟类，给 畜牧业带来损失。 弓形虫主动入侵宿主，主要包括对宿主细胞的黏附、侵入、宿主细胞内陷形 成纳虫空泡、对纳虫空泡进行修饰、速殖子分裂增殖、速殖子破细胞而出及转 化为缓殖子等阶段。弓形虫的顶端复合体在虫体侵入宿主细胞中起着重要的作 用，复合体上的分泌细胞器包括微线体、棒状体和致密颗粒。棒状体含有多种 蛋白，在弓形虫入侵宿主细胞时，可迅速分泌至宿主细胞内或在虫体入侵时分 泌并被纳入至纳虫泡膜(parasitophoms vacuole membrane，PVM)上，主要分 万方数据 摘要布于纳虫泡膜、纳虫泡(Parasitophorous 摘要 布于纳虫泡膜、纳虫泡(Parasitophorous vacuole，PV)内和宿主细胞内(细胞 核和细胞质)，一般将棒状体蛋白(Rhoptry Protein，ROPs)分为两个家族： ROPI、ROP2蛋白家族。ROPl蛋白家族的代表性成员ROPl最初被称为穿透 增强因子(Penetration enhancer factor，PEF)，在入侵宿主细胞的早期阶段有 促进作用，弓形虫一旦侵入宿主细胞，一部分成熟的ROPl蛋白便立即和PVM 联合，并集中在PV中，但在入侵过程完成后的几小时内，ROPl的量显著降低 甚至消失，而另一部分的ROPl则存在于纳虫空泡中。ROP2家族对弓形虫入 侵感染和形成纳虫空泡都是至关重要的效应因子，其成员包括ROP2、ROP3、 RoP4、ROP5、I的P7、ROP8、RoPl6和ROPl8，如ROP2、I的P4、ROP5、 ROP7、ROPl8等参与了纳虫空泡的形成。PV为一个非融合性小室，弓形虫在 入侵宿主细胞后可寄居于内，PVM为弓形虫免受宿主细胞清除提供了保护屏 障，弓形虫在PV内依靠宿主细胞提供的营养物质迅速增长繁殖并破坏宿主细 胞，最后从遭弓形虫破坏而致裂解的宿主细胞中逸出并再次侵入邻近的新细胞 中，如此往复。近期研究表明，ROP2家族不仅在虫体入侵宿主、纳虫空泡修 饰和毒力作用方面表现突出，ROPl8、ROPl6及ROP5还是重要的弓形虫毒力 决定因子，弓形虫ROPl8可通过干扰免疫相关性GTP酶(IRGs)系统来抑制 宿主固有免疫应答，还可靶向作用在内质网膜上的转录激活因子ATF6p来抑制 宿主的适应性免疫应答，使弓形虫具备强毒力，而ROPl6借助自身的核定位结 构(nuclear localization signal，NLS)，在侵入宿主细胞后，迅速移位至宿主细 胞核，使宿主细胞内的信号传导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)STAT3／STAT6发生磷酸化，影响宿主细胞内信号通路 传导，从而干扰宿主细胞的增殖、分化、凋亡等功能。据报道，不同弓形虫株 间ROPl6的基因序列呈多态性。弓形虫感染宿主后，宿主的巨噬细胞、树突状 细胞和中性粒细胞会释放IL．12等细胞因子，诱导继发性免疫反应或直接清除 寄生虫。I型虫株感染细胞后，ROPl6可迅速激活STAT3，随后抑制促炎因子 II 万方数据 硕士学位论文如IL．12的释放，而在II型却未发现此现象。 硕士学位论文 如IL．12的释放，而在II型却未发现此现象。 不同虫株ROPl6的作用不尽相同，那么不同虫株在入侵宿主细胞过程中， ROPl6的分泌和分布情况如何呢?本研究通过对弓形虫ROPl6进行原核表 达，制备其多克隆抗体，运用实时荧光定量PCR实验比较不同虫株在入侵宿主 细胞过程中ROPl6转录水平的差异，相应地，制备抗弓形虫微管蛋白Tubulin 抗体，在运用免疫印迹比较RH株和Pru株ROPl6的表达量时作为内参抗体， 为深入研究不同虫株ROPl6在弓形虫入侵宿