草鱼pigr基因克隆表达及与igm结合活性的研究水产学水产养殖专业论文.docxVIP

immune immune organs in fish，therefore，the expression levels ofpIgR will be higher． We constructed the pIgR prokaryotic expression vector pET-32a，to express pIgR encoding region，and the recombinant proteins plgR was induced to express using Rosetta E．coli expression system．The recombinant plgR protein was purified to be used to make polyclonal antibody by injecting mice． The pcDNA3．1·plgR eukaryotic expression vectorwas built and transfccted into grass carp ovary cell line GCO(Grass carp ovary)．The expression of plgR protein was deteetcdusing the polyelonal antibody (mouse anti fish)in this study the first antibody,and goat anti-mouse antibodylabeledby FITC secondary antibody．Using the grass carp natural IgM and the antibody(rabbit anti grass carp IgM)，the activity of plgR to bind IgM was detected in the peDNA3．1-plgR transfected in GCO． KEY WORDS：Grass carp，Polymeric immunoglobulin receptor,Gene clone，Specific antibody immunofluorescence IV 万方数据 目录摘要 目录 摘要 l ABSTRACT ．1 l l 目录 V 第一章前言 1 1．1 pIgR的分子结构 l 1．2 plgR的基因结构 3 1．3 plgR的表达模式 ．3 1．4 pIgR在黏膜免疫中的重要作用 4 1．5研究目的和意义 5 第二章草鱼p／gR基因的克隆及分析 ¨¨ ．7 2．1实验材料 ．7 2．1．1实验鱼 ．．7 2．1．2试剂 ．．7 2．1．3宿主菌种 ．．8 2．2实验方法 8 2．2．1肠道总RNA提取 8 2．2．2草鱼plgR cDNA中间片段的克隆 ．9 2．2．3草鱼plgR cDNA 3’端序列PCR扩增和测序 一1 4 2．2．4草鱼plgR cDNA 5’端序列PCR扩增和测序 。15 2。2．5草plgR生物信息学分析 ．．1 8 2．3结果与分析 ．．18 2．3．1草鱼肠道总RNA的提取 ．1 8 2．3．2草鱼plgR中间片段的克隆 ．1 9 2．3．2草鱼plgR cDNA 3’端序列的克隆 20 V 万方数据 2．3．3草鱼plgR 2．3．3草鱼plgR eDNA 5’端片段的克隆 20 2．3．4草鱼plgR序列特征分析 ．21 2．3．5草鱼plgR氨基酸序列与其他脊椎动物氨基酸序列同源性分析．24 2．4讨论 。26 第三章草鱼器官组织问plgR mRNA表达差异 。29 3．1实验材料 ．．29 3．1．1实验用鱼 29 3．1．2试剂与仪器 29 3．2实验方法 ．．29 3．2．1 RT-PCR检测plgR mRNA组织的分布 29 3．2．2实时荧光定量PCR检测草鱼pIgR ．31 3．3结果 。32 3．4讨论 。33 第四章草鱼plgR原核表达及其特异性抗体的制备 一35 4．1实验材料 35 4．1．1实验动物及菌种 35 4．1．2实验试剂 35 4．2实验方法 36 4．2．1草鱼pIgR原核表达基因扩增 一36 4．2．2原核表达载体pET-32a(+)的构建 一36 4．2．3 pET-32a表达系统在大肠杆菌Rosetta中诱导表达 38 4．2．4 pIgR蛋白纯化与免疫小鼠 39 4．3结果 ～39 4．3．1 pIgR的ILDl结构域序列扩增 39 4．3．2 pIgR—pET-32a重组载体的构建 40 4．3．3重组载体的诱导表达及纯化 40 4．4讨论 。4l 万方数据 第五章细胞中表达草鱼plgR及其与IgM结合活性的检测