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A. 样品的浓缩效应 缓冲液成分及pH的不连续性 浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液Tris-Gly 解离度 ：?Cl ?蛋 ? Gly mcl?clm蛋?蛋m Gly ?Gly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。 缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图 快离子 慢离子 蛋白质样品 电位梯度的不连续性 E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/?(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。 电位梯度的不连续性 E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/?(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 缓冲液成分及pH的不连续性 电位梯度的不连续性 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括： 凝胶层的不连续性： 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 B.电荷效应 蛋白质样品进入分离胶后 pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 C.分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 五. 盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 （2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应 样品的浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 分离胶 浓缩胶 样品 缓冲液 分离胶 浓缩胶 样品 缓冲液 分离胶 浓缩胶 样品 缓冲液 分离胶 浓缩胶 样品 缓冲液 分离胶 浓缩胶 缓冲液 分离胶 浓缩胶 缓冲液 分离胶 浓缩胶 缓冲液 * * 生物化学实验Biochemical Experiment 生物化学实验技术理论 一、层析技术 1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因．又常称为层析法。 80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。 几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。 一、层析技术 1、层析技术原理 2、层析技术分类 3、常用层析技术原理 1、层析技术原理 层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。 2、层析技术分类 名称 操作方式 固定相 流动相 分离依据 分配层析 纸层析 薄层层析 液体 液体 溶解度 离子交换层析 离子交换柱层析 固体 液体 带电性 静电引力 吸附层析 吸附薄层层析 气体吸附层析 固体 固体 液体 气体 吸附力