茯苓总三萜免疫抑制及诱导人结肠癌rko细胞凋亡的研究药理学专业论文.docxVIP

硕士学位论文茯苓总三萜免疫抑制及诱导人结肠癌RK0细 硕士学位论文 茯苓总三萜免疫抑制及诱导人结肠癌RK0细 胞凋亡的研究 硕士研究生：林嘉 指导教师：雷林生教授 摘要 背景和目的： 茯苓是常用的中药材，其在日常饮食以及临床实践中都显示出良好的应用价 值。在现代研究中发现，茯苓的药理作用主要取决于三萜类化合物和多糖成分。 本文针对茯苓三萜类化合物开展药效学方面的研究，并对茯苓的临床应用前景进 行展望，希望对日后茯苓三萜类化合物的开发应用提供依据。本研究具体包括两 方面的内容，其一是观察茯苓总三萜对小鼠免疫功能的抑制作用，并初步探讨其 体内外对小鼠免疫反应抑制作用的调控机制；其二是观察茯苓总三萜体外对人结 肠癌RKO细胞的增殖抑制作用，初步探讨其诱导细胞凋亡的机制，评估其在抗 肿瘤方面的应用潜力。 实验方法： 1)茯苓总三萜的提取：取茯苓粗块，适当粉碎，加入75％乙醇适量，回流提取 3次，每次2h，趁热过滤，合并上清液，回收乙醇，低温减压干燥，得乙醇 提取物；取乙醇提取物，加适量的水分散，用乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸 乙酯萃取液，回收溶剂，低温减压干燥，得乙酸乙酯提取物(茯苓总三萜)。 21茯苓总三萜体外对小鼠脾细胞功能的影响：本研究采用MTT法检测茯苓总 三萜体外对小鼠脾细胞的增殖或代谢的干预作用，包括Con A刺激下茯苓总 三萜对小鼠脾细胞增殖活力的影响，LPS刺激下茯苓总三萜对小鼠脾细胞增 殖活力的影响，以及通过研究茯苓总三萜对混合淋巴细胞培养反应的影响 来更深入地了解其免疫调控的机理；采用流式细胞术研究茯苓总三萜在Con A诱导下小鼠T细胞亚类的影响。采用ELISA法检测茯苓总三萜对Con A 万方数据 摘要诱导小鼠脾细胞产生细胞因子(IL一2，IFN—y)的影响以及茯苓总三萜对 摘要 诱导小鼠脾细胞产生细胞因子(IL一2，IFN—y)的影响以及茯苓总三萜对 LPS诱导小鼠脾细胞产生抗体的影响。 31茯苓总三萜体内对小鼠免疫功能及大鼠免疫病理模型的影响：采用兔红细胞 免疫小鼠产生血清溶血素(IgM)，之后用分光光度法测定小鼠溶血素的变化。 ELISA法测定其对血清IL-4的影响。通过测定茯苓总三萜对小鼠迟发型超 敏反应(DTH)所造成的耳廓肿胀度以及观察给药后胸腺及脾脏指数的变化来 研究其对细胞免疫功能的影响。在大鼠佐剂性关节炎模型中，采集给药后大 鼠佐剂性关节炎模型关节炎指数、足趾肿胀度、体重等参数，评估其对自身 免疫性疾病的治疗作用。 41茯苓总三萜诱导人结肠癌RKO细胞凋亡的研究：首先将RKO细胞接种于 96孔板，经茯苓总三萜处理后，MTT法检测细胞的增殖活力；然后，接种 RKO细胞于6孔板，茯苓总三萜处理后，DAPI染色观察细胞核形态学变化， JC一1染色观察细胞线粒体跨膜电位变化，Western印迹法检测Bax、Bcl．2、 线粒体细胞色素C(Cyt C)的含量，酶促反应显色法检测caspase 9和caspase 3的活性，评估其凋亡诱导作用及机制。 实验结果： 11 1009茯苓粉末，经提取分离，醇提物平均产量3．239，乙酸乙酯提取物平均 产量1．3969。平均产率分别为3．23％和1．27％。 21除了低浓度茯苓总三萜(1099／mL)对混合淋巴细胞反应的抑制效果不明显 外，10 la g／mL以上浓度茯苓总三萜(20、40、8099／mL)均能显著抑制混合 淋巴细胞培养的增殖反应(代谢活力)，与模型组比较差异有统计学意义，且 有浓度依赖趋势。 31 Con A可以明显促进脾细胞的代谢活力，低浓度茯苓总三萜(1099／mL)虽 然有轻微抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖反应的趋势，但与ConA组比较 差异无统计学意义，而1099／mL以上浓度(20、40、8099／mL)均可以显著 抑制Con A诱导的小鼠脾细胞增殖反应，且有浓度依赖趋势。 41流式细胞术检测茯苓总三萜在Con A诱导下对小鼠T细胞亚类的影响。观察 到Con A能够促进CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+细胞的增殖。茯苓总三萜给 药处理后，高中低浓度均可明显抑制ConA诱导的CD3+和CD3+CD4+细胞的 增殖，而对CD3+CD8+细胞的影响较轻微。 II 万方数据 硕士学位论文5)ELISA法检测到ConA组可以明显诱导正常小鼠脾细胞干扰素Y和白介素．2 硕士学位论文 5)ELISA法检测到ConA组可以明显诱导正常小鼠脾细胞干扰素Y和白介素．2 的分泌，茯苓总三萜各浓度组(80、40、20、10．g／mL)表现出对ConA诱导小 鼠脾细胞分泌干扰素Y和白介素．2的抑制作用，且有浓度依赖趋势。 6)MTT法检测得，LPS组可以明显促进脾细胞的代谢活力，茯苓总三萜各浓度 组(80、40、20、10pg／mL)均可以显著抑制LP