不同载荷机械牵伸通过mtorc1信号通路调节肌腱异位骨化外科学骨外专业论文.docxVIP

硕士学位论文路。使用mTORCl特异抑制剂雷帕霉素或mTORCl基因敲除可以对成骨分化 硕士学位论文 路。使用mTORCl特异抑制剂雷帕霉素或mTORCl基因敲除可以对成骨分化 起到刺激或抑制作用。因此，机械应力可能通过mTORCl信号通路调节肌腱 干细胞的成骨分化，但其机制尚不清楚。 基于前人的报道，我们提出以下假说：机械应力载荷可引起肌腱干细胞中 mTORCl信号通路的改变，从而影响肌腱干细胞的成骨分化。我们课题设计 为：体外分离培养大鼠跟腱来源的肌腱干细胞，并在Flexc=ll FX．5000应力加 载系统中进行不同幅度的牵伸，分别应用Real-time PCR和Western blot检测牵 伸后肌腱干细胞的成骨分化相关因子Runx2和OSX的表达情况。加入 mTORCl特异性抑制剂雷帕霉素抑制肌腱干细胞中的mTORCl信号通路，在 机械牵伸后，分别应用Real．time PCR检测Runx2和OSX的表达情况，明确牵 伸情况下mTORCl信号通路在肌腱干细胞异常成骨分化中的作用。除了对细 胞进行不同幅度机械牵伸，我们还建立了可模拟不同牵伸负荷的动物模型。在 前人研究异位骨化的动物模型基础上，我们应用石膏固定模拟不同幅度的牵 伸。通过免疫组化染色和Micro CT扫描检测应力对于异位骨化的影响。给实 验动物腹腔注射雷帕霉素抑制体内mTORCl信号通路，研究mTORCl信号通 路在肌腱异位骨化中的作用。根据以上假设，我们将课题研究分三部分。 1．不同载荷机械牵伸对跟腱干细胞成骨分化及跟腱异位骨化的影响 1．1分别从基因表达水平和蛋白表达水平两个方面着手，研究肌腱干细胞在不 同牵伸条件下，成骨分化指标Runx2和OSX的表达水平及变化趋势。 1．2实验分组：无牵伸对照组(NS)，4％牵伸强度组(4％)，12％牵伸强度组 (12％)。 1．2．1不同牵伸强度对Runx2和OSX基因表达水平影响 应用Real．time PCR检测不同牵伸条件下跟腱细胞RLrNX2和OSX基因的表 达量，结果显示，4％机械应力刺激下跟腱细胞RUNX2和OSX基因表达较未 经机械应力刺激的细胞显著下降(P0．05)；12％机械应力刺激下跟腱细胞 RUNX2和OSX基因表达较未经机械应力刺激的细胞显著升高(P0．05)。 llI 万方数据 摘要1．2．2不同牵伸强度对Runx2和OSX蛋白表达水平影响 摘要 1．2．2不同牵伸强度对Runx2和OSX蛋白表达水平影响 应用Western blot检测不同牵伸条件下跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白的表 达量，结果显示，4％机械应力刺激下跟腱细胞RUNX2和OSX蛋白表达较未 经机械应力刺激的细胞显著下降(PO．05)；12％机械应力刺激下跟腱细胞 RUNX2和OSX蛋白表达较未经机械应力刺激的细胞显著升高(PO．05)。 1．2．3应用HE染色及Micro CT扫描检测不同牵伸强度对跟腱异位骨化的影响 1．2．1实验分组：无牵伸对照组(Ctrl)，低幅度牵伸组(LE)，高幅度牵伸组 (髓)。 1．2．2不同牵伸强度对跟腱异位骨化的影响 1．2．3 Ctrl组、LE组和HE组大鼠右侧跟腱HE染色显示，三组跟腱均有异位骨 化发生，出现骨髓腔，成骨样细胞。LE组较Ctrl组异位骨化程度轻，而HE组 较Ctrl组及LE组异位骨化程度要中重。Ctrl组、LE组和脏组大鼠右下肢 Micro CT扫描显示，LE组异位骨化BV／TV、n．N、Tb．T数值均较Ctrl组显著 下降(P0．05)；HE组组异位骨化BV／TV、1’b．N、Tb．T数值均较Ctrl组显著 升高(P0．05)。 2．不同幅度机械应力对跟腱细胞及大鼠跟腱mTORCl信号通路的影响 2．1从蛋白表达水平着手，研究肌腱于细胞在不同牵伸条件下，磷酸化p70s6k 的表达水平及变化趋势。 2．1．1实验分组：无牵伸对照组(NS)，4％牵伸强度组(4％)，12％牵伸强度 组(12％)。 2．2．2机械牵伸对肌腱干细胞中磷酸化p70s6k蛋白表达水平的影响 应用Western blot检测不同牵伸条件下跟腱细胞p-P70S6K蛋白的表达量，结果 显示，4％机械应力刺激下跟腱细胞P．P70S6K蛋白表达较未经机械应力刺激的 细胞显著下降(PO．05)：12％机械应力刺激下跟腱细胞P．P70S6K蛋白表达 较未经机械应力刺激的细胞显著升高(PO．05)。 2．2．3应用免疫组化染色检测不同牵伸强度对跟腱磷酸化p70s6k表达水平的影 IV 万方数据 硕士学位论文响 硕士学位论文 响 2．2．1实验分组：无牵伸对照组(Ctrl)，低幅度牵伸组(LE)，高幅度牵伸组 (髓)。 2．2．2不同牵伸强度对跟腱mTORCl信号通路的影响 各组大鼠右侧跟腱免疫组化染色