产几丁质酶菌株的筛选与酶学性质研究生物工程专业论文.docxVIP

Classifled Classifled Index： Code：10224 Confidential(yes／no)：I10 NO．：130920849 Dissertation for the Professional Master Degree Isolation of a Chitinase—-Producing Strain and Charaeteration of Its Chitinase Candidate：Zhang Yuan Sill3 Gao Jig UO nan Jl’eJ Degree Category：Master of Engineering College：College of Life Science Research Field：Bioengineering Study Mode：Full—time Harbin China June 2015 万方数据 匕I 匕I 录 目 录 摘要 ．．I 英文摘要 III l前言 一1 1．1产儿丁质酶微生物的种类 ．1 1．2微生物儿_J质酶的特点 2 1．3几丁质酶的分类 2 1．4儿丁质酶的测定方法 3 1．4．1儿uJ^质酶总酶活力的测定方法 一3 1．4．2内切儿J一质酶活力的测定方法 一3 1．4．3 N．乙酰．葡萄糖胺酶酶活力的测定方法 一3 1．4．4几丁二糖水解酶活力的测定方法 4 1．5 JL]‘质酶的理化性质 4 1．5．1分子量 ．4 1．5．2最适pH及等电点(p1) 4 1．5．3最适温度 一4 1．5．4金属离子的影响 4 1．6儿丁质酶基因的克隆 5 1．7微生物儿丁质酶基因的结构 ．5 1．7．1催化I又： 6 1．7．2儿丁质结合区 ．6 1．7．3 FnllI结构域 ．．7 1．7．4 Cadherin—like结构域 7 1．8几丁质酶的应明 7 1．8．1抑制病原真菌生长 ．7 1．8．2生物酶法生产儿丁寡糖的应用 一8 1．8．3提供菌体蛋白 一8 1．9研究的目的意义与内容 8 1．9．1研究的目的意义 一8 1．9．2研究的内容 ．9 1．9．3课题来源 ．9 2材料与方法 10 2．1实验材料 ．10 2．1．1菌种来源 ．10 2．1．2供试病原真菌 ．10 2．2试剂与仪器 一lO l 万方数据 东北农业火学工程硕：L学位论文2．2．1试齐U．． 东北农业火学工程硕：L学位论文 2．2．1试齐U．． ． ． ． ． ． ．10 2．2．2仪器 ． ． ． l 1 2-3土要培养基和配制方法 一12 2．4十壤中产儿。丁质酶菌株筛选 13 2．4．1 Bt几_J^质酶产酶菌的筛选 13 2．4．2品体形态观察 13 2．5 Bt儿丁质酶基因的克隆和表达 13 2．5．1 Bt儿J．质酶基因的克隆 13 2，5．2 DNA回收 13 2．5．3 E．coli感受态细胞制备 一14 2．5．4连接反应 14 2．5．5大肠杆菌热激转化 14 2．5．6 Ecoli质粒DNA提取 14 2．5．7基因诱导表达及SDS—PAGE分析 15 2．6 Bt几丁质酶活性测定 1 5 2．7 DH值和温度对Bt儿丁质酶活力的影响 ．15 2．8非Bt儿J一质酶产酶菌的筛选与鉴定 一15 2．8．1菌株的筛选与形态特征观察 15 2．8．2分子水平鉴定 ．16 2．9比色法测定产酶菌的酶活力 16 2．9．1比色法测定产酶菌的酶活力原理 ．16 2．9．2酶活体系测定的优化 ．16 2．9．3酶活的测定 ．17 2．9．4N一乙酰氨基葡萄糖标准曲线的制作 一17 2．10 YM9．2菌株的几丁质酶基因的克隆和测序 。18 2．1l YM9—2菌株抑制真菌活性的研究 18 3结果与分析 19 3．1 Bt晶体形态观察 19 3．2 Bt几丁质酶基因的克隆表达与酶活性测定 ．．． ．19 3．2．1几丁质酶基因chiA73的克隆和序列分析 一19 3．2．2几丁质酶ChiA73蛋白结构分析 一20 3．2．3 chiA73在大肠杆菌中的表达 ．．2I 3．2．4原菌发酵液与表达蛋白ChiA73的活性检测 21 3．2．5 pH值和温度对几丁质酶ChiA73活性的影响 ．．22 3．3产)L-I一质酶菌株筛选结果 23 3．4生长形态和培养特征 23 3．4．1 YM9—2菌落培养形态特征 ．23 3．4．2 YM9—2菌株生长特征 一24 II 万方数据 I] I] 录 3．5 YM9—2菌株的16SrRNA序列分析 ．．24 3．6比色法测定产酶茵的总酶活力 25 3．6．1 N．乙酰氨基葡萄糖标准曲线 ．25 3．6．2酶活体系的测定 25 3．6．3 YM9—