磁标记羊膜间充质干细胞移植对大鼠海马齿状回组织再生的实验研究外科学神经外科专业论文.docxVIP

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 慨p“年办衫日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 一：涤本 日期：≯¨年办乡R r———一 r———一 磁标记郑州大学第一附属医院神经外科 磁标记 郑州大学第一附属医院神经外科 河南郑州450052 摘 要 背景和目的 脑外伤、脑出血和脑梗塞等脑损伤是人类致残的主要原因，存在抢救存活 后预后差，目前无特殊治疗方法。本研究通过三个阶段探讨磁标记羊膜间充质 干细胞移植对大鼠海马齿状回组织再生的影响。1、羊膜组织来源的细胞通过细 胞形态学观察、流式细胞仪检测、MTT法细胞活性检测和神经元样细胞分化等 鉴定为问充质干细胞，为超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)标记细胞的实验研究提供干细胞来源。2、采用SPIONs 单次和多次标记法标记羊膜间充质干细胞，探讨SPIONs标记羊膜间充质干细胞 的安全浓度，明确SPIONs安全浓度对羊膜问充质干细胞向神经元样细胞分化的 影响；通过磁共振检测SPIONs标记的干细胞在体外和体内的信号存在和改变， 为羊膜I、日J充质干细胞移植治疗相关疾病的活体示踪提供实践基础。3、SPIONs 标记的羊膜间充质干细胞移植入缺血缺氧性脑损伤侧脑皮质，MRI示踪干细胞 移植后在宿主脑内分布和迁移情况，实现活体的无创性和连续性动态监测；通 过免疫组织化学染色检测海马齿状回组织的再生，探讨干细胞在组织再生中扮 演的角色。 摘要材料和方法： 摘要 材料和方法： 1．羊膜间充质干细胞的原代培养和神经元样细胞分化 酶消化和贴壁培养法获取羊膜组织中细胞，通过细胞形态学观察、流式细 胞仪检测、MTT法细胞活性检测和神经元样细胞诱导分化等鉴定羊膜来源的间 充质干细胞。P3代生长状态良好的羊膜间充质干细胞培养于细胞诱导培养基， 诱导细胞分三组。在1，2，4和7天分别进行1、MTT法分析细胞诱导培养基的 细胞毒性；2、流式细胞仪分析间充质干细胞膜表面特异性分子的改变；3、RT-PCR 和免疫细胞化学染色探讨羊膜问充质干细胞向神经元样细胞分化的潜能。 2．SPIONs标记羊膜间充质干细胞在体内外细胞磁共振成像 SPIONs的浓度分别是3．5，7，14，and 28 l上g／ml的细胞生长培养基(Cytokine Growth Medium，CGM)或细胞诱导培养基(CIMl应用于本研究。两种SPIONs 标记法应用于本研究：1、单次SPIONs标记法：细胞培养首次(O d)更换的培 养基含SPIONs，此后ld、2d和4d更换的培养基不含SPIONs；2、多次SPIONs 标记法：细胞培养首次(0 d)更换的培养基含SPIONs，此后1d、2d和4d更换 的培养基含SPIONs。根据和细胞培养基不同和SPIONs的标记方法不同分为六 组：1、细胞生长培养基组；2、细胞生长培养基+单次SPIONs标记组；3、细胞 生长培养基+多次SPIONs标记组；4、细胞诱导培养基组；5、细胞诱导培养基+ 单次SPIONs标记组； 6、细胞诱导培养基+多次SPIONs标记组。 细胞生长培养基(CGM)培养的细胞分别收获于l、2、4和7 d，各时间 点获得细胞分为三组分别行MTT法、普鲁氏蓝染色和流式细胞仪检测；细胞诱 导培养基(CIM)培养的细胞分别收获于l、2、4和7 d，各时间点获得细胞分 为三组分别行MTT法、普鲁氏蓝染色、免疫细胞化学染色、RT-PCR和流式细 胞仪检测；无SPIONs的细胞生长培养基组和细胞诱导培养基组作为对照组。 羊膜问充质干细胞培育于SPIONs浓度分别为3．599／m、7 gg／ml、14 gg／ml 和28 gg／ml的细胞生长培养基，共同孵育1天后消化、离心，悬于1．5 ml l％琼 脂糖的Ependoff管，