Application定量PCR之应用速度篇.PDF

Application 定量 PCR 之应用速度篇 Comparison of xxpressNGx® to peltier system 120 ) C ° 100 ( e r 80 u t a 60 r e p 0 5 10 15 20 25 m e Time (s) T Peltier xxpress® 一、影响 PCR 反应时间的因素 ①模块升温和降温时间 PCR/qPCR 反应都是由变性、退火、延伸 3 个步骤循环组成。一般 qPCR 设计每 步需要保持 20-30 秒或以上。以最费时间的延伸步骤为例，qPCR 扩增子通常就 100 多 200bp 大小，对于合成效率 20-30 秒/kb 的 Taq 聚合酶来说 5-6 秒已经足够从头 到尾合成一轮，多余的时间又不能干别的，为啥设计上要停留 20-30 秒呢？解链变性 和退火这两步单纯热力学不涉及酶反应的，200bp 不到的片段更是应该就几秒就够 了，不需要纠缠 20-30 秒那么久？实际上—— 对于 PCR 反应而言，最重要的莫过于温度控制的准确性。由于 PCR 是一个几何级 数扩增的过程，不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，对退火而言温控显 得尤为重要。有时，退火温度相差 1ºC，就能带来迥然不同的结果。目前，市场上的 大多数 PCR 仪采用 Peltier 元件加热，温度准确性在 ±0.3ºC 左右。温度控制算法的精 确性无疑会影响温度控制的精确。传统的 peltier 模块有明显的温度过冲效应 ，需要非 常丰富的经验，精确的算法才可使不同体积的样本达到稳定的设置点温度且无过冲及 相关的负面效应。PCR 仪的温度传感器一般是在模块下面的，也就是说仪器实际能够 控制的是模块的温度，Block 模式指的就是仪器以控制 Block 的温度为目的，也就是 说你输入 95 度 5 分钟，则模块的温度达到 95 度后开始计时，5 分钟后完成。这是最 基本的控温模式。但是，实际上我们输入 95 度 5 分钟是希望 PCR 管内的温度达到 95 后开始计时 5 分钟。PCR 仪器开发人员可以先将模块温度控制到 97 度（比如如果不 超过 95 度，管内温度很长时间才能达到 95 度或根本达不到），过几秒钟后，等到管 内温度达到 95 度，再将模块温度降到 95 度。这样做既达