法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞间质转分化影响内科学内分泌与代谢疾病专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞间质转分化影响 温州医学院硕士学位论文 法舒地尔对高糖培养肾小管上皮细胞间质转分化影响 中文摘要 目的： 糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)已成为终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)的第二大原因，糖尿病肾病时肾小管上皮细胞可发生转分化， 并且该转分化过程在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用。近来人们发现，肾脏 中RhoA／ROCK信号通路具有重要的功能。ROCK的特异性抑制剂法舒地尔 (fasudil)对肾脏的保护作用已经在多种肾脏损害模型中得到证实。但是迄今， 有关Rho A／ROCK通路阻断对高糖所致的肾小管上皮细胞EMT影响的研究还未 见报道。为进一步阐明法舒地尔对DN中肾小管问质病变的保护作用，我们拟高 糖培养人肾小管上皮细胞(HK．2)，采用反映上皮细胞表型特征的上皮钙粘素 (E．cadherin)和反映MyoF表型特征的Q．平滑肌肌动蛋白(0【．SMA)作为指标， 观察高糖培养所诱导的EMT现象，以及应用不同浓度的法舒地尔作干预试验。 旨在从EMT这一新途径，进一步探讨DN发病具体机制及法舒地尔对糖尿病肾 脏的保护作用的新机制。 方法： 利用台盼蓝染色和MTT实验分别在0、5、10、20、30、100 I．tmol／L的法舒 地尔浓度巾选择合适浓度作用干预实验浓度；应用细胞培养技术，按下列实验条 件培养人肾小管上皮细胞(HK．2)：正常糖浓度组ⅢG)(葡萄糖浓度5．5 mmol／L)； 高糖组(HG)(葡萄糖浓度60 mmol／L)；高张组(HM)(葡萄糖浓度5．5 mmol／L+甘 露醇54．5 mmol／L)：小剂量法舒地尔+高葡萄糖组(法舒地尔Fasudil 5pmol／l，+葡 萄糖浓度60 mmol／L)；中剂量法舒地尔+高葡萄糖组(法舒地尔Fasudil 10pmol／1，+ 葡萄糖浓度60 mmol／L)；大剂最法舒地尔+高葡萄糖组(法舒地尔Fasudil 20pmol／l+葡萄糖浓度60 mmol／L)；(注：法舒地尔选择浓度为本实验所得)。倒 置相差显微镜观察HK．2细胞形态；采用免疫荧光细胞化学技术和Western blot 技术检测HK．2细胞中EMT标志物E．钙黏素(E．cadherin)和平滑肌肌动蛋白 f0【．SMA)的表达；应用配体结合沉淀法(pull．down assay)检测HK．2细胞中Rho A活性；免疫共沉淀法检查HK．2细胞磷酸化MYPT-Thr696以评估Rho激酶的 活性；ELISA法检测HK．2细胞培养液上清TGF．D1含鼍。 结果： 法舒地尔浓度为5、10、20 lamol／LHq‘，对HK一2细胞死亡和增殖无明显影响。NG 组HK．2细胞呈鹅卵石样形态；60 mmol／L高糖培养9天后，细胞呈现梭形样改变； 温州医学院硕士学位论文20 温州医学院硕士学位论文 20 pmol／L法舒地尔同步干预9天后，细胞形态与正常糖浓度组比较未见明显差 异。在一定时间范围内，60 mmol／L高糖能刺激HK一2细胞RhoA分子及ROCK分 子活化。与正常对照组比较，60 mmol／L高糖培养HK．2细胞72 h后上皮钙黏素表 达明显减少，Cc．SMA表达明显增多，高张组与正常对照组差异无统计学意义。法 舒地尔同步干预后，与高糖组比较，细胞上皮钙黏素表达增多，u．SMA表达下降， 且与法舒地尔浓度呈浓度依赖性。与正常对照组比较，60mmol／L高糖培养HK一2 细胞24、48、72h后TGF．D1分泌增多，且呈时间依赖性。法舒地尔同步干预后， 与高糖组比较，TGF．13．分泌减少。 结论： 高糖培养的HK．2细胞E．cadherin蛋白表达减少，o．-SMA蛋白表达增多，细胞 形态呈肌成纤维细胞样改变，即高糖能诱导HK．2细胞发生EMT。高糖能激活 HK．2细胞内Rho A／ROCK信号通路，Rho A／ROCK信号通路抑制剂法舒地尔可下 调高糖诱导的HK．2细胞EMT，从而对DN起保护作用。法舒地尔能抑制高糖培养 的肾小管上皮细胞转分化，可能部分通过减少TGF．pl的分泌而产生作用。 关键词：法舒地尔；肾小管上皮细胞；肾小管上皮细胞．肌成纤维细胞转分化； 糖尿病。肾病 4 温州医学院硕士学位论文Effect 温州医学院硕士学位论文 Effect of Fasudil on High Glucose—induced Renal Tubular Epithelial—myofibroblast Transdifferention ABSTRACT obj ectives： DN has become the second leading cause of end-st