超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药微泡复合物抗肿瘤研究影像医学与核医学超声诊断学专业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 超声辐照联合酸敏双配体阿霉素前药一微泡 复合物抗肿瘤研究 硕士研究生：罗婉贤 指导教师：李颖嘉教授 实验指导老师：王莺副研究员 摘要 背景与目的： 阿霉素(Doxorubicin，DOX)是一种临床常用的蒽环类抗肿瘤药物。由于阿 霉素可引起严重的心脏毒性、肾毒性及骨髓抑制等多种毒副作用，限制了其临 床应用。因此，亟待发展一种新的肿瘤治疗策略以提高其治疗效果，降低毒副 作用。 研究发现，正常组织微环境呈中性，pH值约7．4，而肿瘤微环境中由于乏氧、 低灌注以及乳酸代谢水平较高，其pH值可低至6．0。在载药体系中引入具有酸 敏特性的化学键可使载药体系进入肿瘤组织后，在肿瘤酸性微环境的刺激下释 放出化疗药物，而在体内正常组织中性微环境中则保持相对稳定。该策略可实 现化疗药物在肿瘤区域的靶向释放，降低其毒副作用，提高药物抗肿瘤效率。 在抗肿瘤药物研究中，引入靶向配体亦是增强药物靶向性的重要策略。据 文献报道，整合素av[B3在肿瘤新生血管内皮细胞及部分肿瘤细胞中高表达，精 氨酸一甘氨酸一天冬氨酸序列(Arg—Gly—Asp，简称RGD序列)是大多数整合素 结合配体最常见的识别位点，．但线型肽稳定性较差、体内易降解，而环状RGD (即cRGD)，是一个基于二硫键循环的RGD肽，氨基酸序列为 (cyclo—Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)，稳定性好，可与整合素avlB3特异性结合，有 万方数据 摘要助于载药体系靶向肿瘤微血管，同时抑制肿瘤新生血管形成，在一定程度上产 摘要 助于载药体系靶向肿瘤微血管，同时抑制肿瘤新生血管形成，在一定程度上产 生抗肿瘤作用。叶酸受体作为另一个常用的肿瘤细胞靶点，在多种肿瘤细胞中 高表达。在载药体系中引入cRGD肽和叶酸，可使载药体系在cRGD肽与整合 素avl33的特异性识别下首先靶向结合于肿瘤区域血管床，然后在叶酸和cRGD 的作用下靶向结合于肿瘤细胞，从而发挥双重肿瘤靶向作用。 据此，我们将腙键的酸反应性及双配体的靶向性结合，制备一种酸敏双配 体阿霉素前药。该前药以肝素为载体，通过碳二亚胺法连接双配体叶酸和cRGD 肽，cRGD肽经聚乙二醇(PEG)修饰以逃避网状内皮系统吞噬及延长药物体内 循环时间。化疗药物阿霉素则经酸敏腙键连接至载体上以促进其在肿瘤酸性微 环境中的靶向释放。实验证明该前药具有比非酸敏双配体阿霉素前药及游离阿 霉素更强的抗肿瘤能力。但随之我们发现酸敏键引入后，随着载药量增加纳米 粒出现团聚，粒径增大，不利于载药体系在肿瘤内的进一步弥散和滞留，这也 是目前各种药物传输体系在体应用时普遍面临的问题。 超声靶向微泡破坏技术(Ultrasound。targeted microbubble destruction，UTMD) 是一种有效的药物运输辅助手段，可促进药物定点释放。微泡破裂产生的微声 流、冲击波及微射流等惯性空化作用可增加内皮间隙和细胞膜通透性，可有效 地提高肿瘤部位的药物摄取，增强肿瘤细胞内药物蓄积。针对上述纳米粒团聚 现象，我们期望利用超声空化的物理力学作用辅助团聚的载药体系分散均匀， 提高应用效率。 本实验通过生物素．亲和素桥将团聚的酸敏双配体阿霉素前药与微泡结合， 形成酸敏双配体阿霉素前药．微泡复合物，并探讨微泡介导的超声辐照作用是否 能将团聚的大粒径载药颗粒分散破碎成小粒径颗粒，从而增强肿瘤细胞对药物 的摄取。本实验对超声作用前后酸敏双配体阿霉素前药及其复合物的形态及粒 径变化进行考察，并通过系列体内外实验探究该策略的肿瘤靶向性、抗肿瘤能 力及相关机制。 材料与方法： 1．合成酸敏双配体阿霉素前药 万方数据 硕士学位论文按摩尔比称取一定量的羧基化肝素、氨基化叶酸、氨基化生物素、PEG．cRGD 硕士学位论文 按摩尔比称取一定量的羧基化肝素、氨基化叶酸、氨基化生物素、PEG．cRGD 以及催化剂量的1．乙基．(3．二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCI)、羟基 琥珀酰亚胺(NHS)下溶于二甲基亚砜(DMSO)qb，室温反应24 h后置于透析膜中 透析48 h。通过腙键将阿霉素连接于载体肝素上，得酸敏双配体阿霉素前药。 2．酸敏双配体阿霉素前药的表征 动态光散射仪测量酸敏双配体阿霉素前药的粒径大小；透射电镜观察酸敏 双配体阿霉素前药的形态及粒径；紫外分光光度法测定载药量。 3．酸敏双配体载阿霉素前药．微泡复合物的制备 3．1生物素化脂质微泡的制备 按摩尔比称取一定量的DSPC、DPPE．Biot置于三颈瓶中，加入泊洛沙姆 (F188)、PEG4000及25 mL蒸馏水，70 oC水浴搅拌30 min，冷却至室温。 把配制好的脂质混悬液加入至50 mL聚丙烯管内，将剪切刀头插至液面下，通 入全氟丙烷气体2 min并进行剪