东方田鼠kpna2基因克隆及抗日本血吸虫实验研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

洲II 洲II I[1llIIq II IItllllllUllllqllll Y1 9 1 857 1 卜 原创性声明 II 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：蜱 学位论文版权使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校町以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：鞠作者签名l蛰盏!翌 导师导师 冽 ? 卜 卜 1I 本课题受如下基金资助： 国家自然科学基金资助项目 项目号国家自然科学基金资助项目 项目号湖南省研究生科研创新项目 项目号：2340．74236000001 t t A K 、 博+学位论文 博+学位论文 中文摘要 摘要 、 卜 ● 东方田鼠是迄今发现对日本血吸虫抗性最强的啮齿类哺乳动物。 从东方田鼠体内分离其抗日本血吸虫的抗性物质，有助于人类从分子 水平上揭示东方田鼠天然抗日本血吸虫的机理也有助于血吸虫病防 治新型手段的研发。在前期研究中，我们从东方田鼠骨髓cDNA文库 中分离获得了一个具有显著体外杀伤日本血吸虫童虫的次级亚基因 池gE76。因此，我们拟从次级亚基因池萨76中继续分离单个活性的 基因，并探讨其生物学功能。 一、东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因gE76．44的筛选 实验利用表达克隆法对有较高体外杀伤日本血吸虫童虫活性的 东方田鼠骨髓次级亚基因池gE76进行了筛选。将其转化大肠杆菌 DH5a并铺板，随机挑取246个单克隆，分别进行质粒DNA抽提， EcoR I酶切，1．0％琼脂糖凝胶电泳检测，共获取153个有插入片段 质粒，选择插入片段≥800 bp的不同重组质粒37个，转化大肠杆菌 DH5a并提取质粒DNA，转染HEK293 T细胞，制备条件培养基后， 进行体外杀伤日本血吸虫童虫实验，在96 h内连续观察童虫死亡情 况，统计死亡率，共获得四个杀虫效果较为显著的克隆： 44号、69 号、85号及109号，其童虫死亡率分别为16．7％、16．5％、10．4％、 11．3％，与对照组比较具有统计学意义。经测序后其EST序列长度 分别为2 008 bp、l 626 bp、l 420 bp、828 bp。序列同源性比较发现： 44号为核转运受体蛋白质karyopherin(importin)alpha 2，其序列中包 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 含全长ORF，根据测序及多次重复杀虫实验结果，我们把44号基因 二I 作为从东方田鼠骨髓基因表达文库中筛选到的新的候选抗日本血吸 一 - 虫相关基因，暂时命名为Mf-gE76．44进行下游实验。 二、gE76．44基因生物信息学分析及其功能分析 运用生物信息学方法对东方田鼠抗性相关基因gE76．44全长核苷 酸序列进行结构和功能分析，BLASTN同源性比对发现：gE76．44与 小鼠karyopherin alpha 2(KPNA2)(NM-0 10655)的序列相似性为 89．8％；多序列比对分析发现：小鼠、牛、人、大鼠和东方田鼠KPNA2 的核苷酸及氨基酸序列存在差异；3D．JrIGSAW(version 2．O)软件分析 结果也证明东方田鼠和小鼠KPNA2蛋白分子立体结构上也存在明显 差异。实验将小鼠KPNA2(Ms—KPNA2)基因重组到真核表达载体 pcDNAl．1，分别制备东方田鼠(MfiKPNA2)及小鼠(Ms-KPNA2) KPNA2条件培养基，检测两者真核表达产物体外杀伤日本血吸虫童 虫效果。扣除窄白对照组童虫死亡率，Mf-KPNA2和Ms．KPNA2的 条件培养基杀虫率分别为15．8％， 2．8％，两者相比差异显著(P= 0．003)。实验还从mRNA水平比较分析了KPNA2在正常东方田鼠和 小鼠体内不同组织中的表达情况以及感染日本血吸虫Od，7d，12d后 KPNA2基因在肝脏和肺脏组织中的表达。结果