免疫学检测与抗体技术.ppt

(二)抗体库技术 (三)产生嵌合抗体的小鼠和产生人抗体的小鼠 利用基因打靶和取代的方法以及转基因技术产生嵌合抗体。 通过转基因、基因缺失及杂交和选择等一系列过程，获得双转染基因(人H、?链基因)的纯合小鼠。其脾、淋巴结、骨髓中的B细胞可表达人的??链。 (四)细胞内抗体 *细胞内抗体是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体,亦称为内抗体(intrabody)。 *若在抗体基因的N端或C端加入引导序列就能使抗体表达定位亚细胞部位,如胞浆、线粒体、内质网或细胞核部位。 *若在细胞内表达特异识别与肿瘤发生有关的癌基因编码的抗体,即可抑制癌基因编码产物的表达,可用于肿瘤的治疗。 *细胞内免疫用于病毒性疾病的治疗 *抗EGFR胞外区的ScFv-R IR,并在ScFv-R IR的C-末端连接KDEL肽,提供ER滞留 (五)基因工程抗体衍生技术 1．双特异性抗体(BsAb)或称双功能抗体(BfA)。 2. 抗体的抗原化技术：借助人源化抗体的构建方法，以抗体V区作为分子载体来表达生物学相关的多肽或外源性抗原表位，即抗原化抗体(antigenized antibody,AbAg)。 3．抗体重组免疫毒素 4.催化抗体(catalytic antibody)或抗体酶(abzyme)：将催化活性引入抗体的结合部位,产生一种具有抗体和酶双功能的蛋白质,称为抗体酶或程序性酶(programmable enzyme)。 十、杂交瘤技术与T细胞克隆技术 一、杂交瘤技术 1. B细胞杂交瘤技术与单抗的制备 2. T细胞杂交瘤技术与其功能的研究 二、 T细胞克隆技术 *按其特异性分为抗原特异性和非特异性T细胞克隆。 *按其功能则可分为辅助性和细胞毒性T细胞克隆。 (一)抗原特异性T细胞克隆 (二)抗原非特异性T细胞克隆的制备 (三)同种反应性TH和CTL克隆的制备 (四)肿瘤抗原特异性CTL克隆 细胞凋亡的检测 一、概述 细胞凋亡(apoptosis,Apo)是生物体内无用的、老化的一些损伤细胞自动死亡的一种形式，是指在一定的生理和病理情况下,机体为维护内环境的稳定,通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。 二、细胞凋亡与细胞坏死的区别 *细胞坏死是细胞膜,线粒体膜结构、流动性、渗透性及受体等均受损, 进而细胞溶解、坏死；而细胞凋亡时上述结构和功能均保持不变； *细胞坏死时,ATP和蛋白质合成抑制及终止;细胞凋亡时,ATP、mRNA和蛋白质合成依旧,细胞第二信号系统仍活动; *细胞坏死时,细胞DNA随机降解,电泳不呈梯状图谱;细胞凋亡时,DNA多降解成180～200bp或其倍数的梯状片段,电泳呈梯状图谱; *细胞坏死时,细胞内容物外溢,引起局部炎症反应或组织损伤;细胞凋亡时,细胞内容物不外溢, 所以不引起炎症反应或局部损伤; *细胞坏死时,往往是成团细胞死亡;细胞凋亡时,在组织中呈分散状态分布。 三、研究细胞凋亡的意义 1. 细胞凋亡在肿瘤形成和治疗中具有重要作用。 *凋亡基因与抗凋亡基因突变 →→易形成肿瘤； *免疫效应细胞表达FasL, 肿瘤细胞表达Fas→→诱导肿瘤细胞凋亡 →→抗肿瘤 *肿瘤细胞高表达FasL→→诱导免疫细胞凋亡 →→抑制免疫功能→→逃避免疫监视 *肿瘤细胞低表达或不表达Fas →→逃避免疫监视 2. 细胞凋亡与免疫学的关系 *细胞凋亡与T细胞在胸腺的发育 *细胞凋亡与成熟T细胞：AICD *细胞凋亡与与B细胞 *细胞凋亡与胞毒效应 3.细胞凋亡参与自身免疫病的发生 4.细胞凋亡与病毒感染 *抗病毒免疫防御 *细胞凋亡与AIDS *细胞凋亡与病毒性肝炎 细胞凋亡的检测方法 一、形态学方法 1．普通光学显微镜检测法 2．荧光显微镜检测法 材料：①石蜡切片;②冰冻切片;③细胞学涂片。 方法一：①PI染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；②DAPI染液；③AO染液： *荧光显微镜下观察。PI染色选用600nm的激发光,DAPI选用460～500nm的激发光,AO染色选用520nm的激发光。 *HE染色核DNA呈蓝色,而PI染色呈红色,DAPI染色呈蓝白色,AO染色呈黄绿色。凋亡细胞呈现核浓缩,染色加深,或核染色质呈新月形聚集于核膜一边;晚期凋亡细胞表现为核碎裂成大小不等的圆形小体被细胞膜包绕,即凋亡小体。 方法二：Hoechst